Работа 11. Качественные реакции на фосфопротеиды

(на примере казеина молока)

 

Простетической группой фосфопротеидов является остаток фосфорной кислоты, который эфирной связью соединен с гидроксилом серина или треонина белковой части. Фосфорная кислота составляет 0,4-0,9% от массы молекулы фосфопротеида. К фосфопротеидам относятся казеиноген (казеин) молока, вителлин, вителленин и витин яичных желтков, ферменты – фосфорилаза, фосфоглюкомутаза и многие другие.

Казеиноген является полноценным белком, содержащим все незаменимые аминокислоты. В молоке он связан не только с остатком фосфорной кислоты, но и с ионами кальция. Свертывание молока при подкислении объясняется выпадением осадка казеиногена. Под действием пищеварительных ферментов (пепсин, химозин) казеиноген превращается в казеин, что сопровождается свертыванием (створаживанием) молока.

Присутствие фосфопротеидов в материале можно обнаружить реакциями на фосфаты.

 

Реактивы. Биуретовый реактив^*; молибдат аммония в азотной кислоте^*; азотная кислота, конц.; гидроксид натрия, 10%-ный раствор; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 1 М растворе соляной кислоты.

Оборудование. Весы аптечные с разновесом; штатив с пробирками; стеклянные палочки; пипетки вместимостью 5 мл; водяная баня.

Материал. Казеин, сухой порошок.

 

Метод основан на обнаружении в гидролизатах казеина белкового компонента по биуретовой реакции, а фосфорной кислоты – по реакции с молибдатом аммония, в результате которой образуется фосфомолибденовый комплекс:

 

H₃PO₄ + 12(NH₄)₂MoO₄ + 21HNO₃ → (NH₄)₃(PO₄∙12MoO₃) + 21NH₄NO₃ + 12H₂O

молибдат фосфомолибдат аммония

аммония

 

Под действием восстановителей (аскорбиновая кислота) фосфомолибдат аммония переходит в молибденовую синь.

Ход определения. В пробирку отвешивают 0,1 г сухого порошка казеина. Добавляют 5 мл раствора гидроксида натрия и ставят в кипящую водяную баню на 30 мин.

После охлаждения отбирают в пробирку 10 капель гидролизата и проводят реакцию с биуретовым реактивом, добавляя его 3-5 капель. Отмечают появление характерного окрашивания.

В другую пробирку вносят 20 капель гидролизата и нейтрализуют его, прибавляя по каплям концентрированную азотную кислоту до слабой реакции (по лакмусовой бумаге, кусочек которой заранее помещают в пробирку). Затем добавляют 10 капель раствора молибдата аммония, перемешивают содержимое встряхиванием и наливают 10 капель раствора аскорбиновой кислоты. Вновь перемешивают и оставляют стоять пробы до развития специфического окрашивания.

Оформление работы. Отметить результат проведенных качественных реакций, в выводе указать химическую природу казеина молока.

Практическое значение работы. Качественные реакции на фосфатную группу используются для обнаружения фосфопротеидов в исследуемых образцах.

 

 

Работа 12. Количественное определение содержания сиаловых кислот

в сыворотке крови методом Гесса

 

Реактивы. Раствор трихлоруксусной кислоты, 10%-ный раствор; уксусно-сернокислый реактив (95 мл ледяной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1,0; 5,0; центрифуга; водяная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на способности нейраминовой кислоты, освобождающейся при гидролизе сывороточных гликопротеидов, образовывать окрашенные соединения при нагревании с уксусно-сернокислым реактивом.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1,0 мл сыворотки крови и добавляют 1,0 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку помещают в кипящую водяную баню точно (!) на 5 минут. Охлаждают под струей воды в течение 5 минут. Встряхивают и центрифугируют 5 минут при 3000 об/мин. Отбирают 0,4 мл надосадочной жидкости, переносят в пробирку, наливают 5,0 мл уксусно-сернокислого реактива и помещают на 30 минут в кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры и интенсивность окраски определяют на ФЭКе при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете толщиной 10 мм против контроля. Контролем служит уксусно-сернокислый реактив.

Расчет. Определите количество сиаловых кислот по калибровочному графику и рассчитайте содержание по формуле:

 

а∙5∙100

Х = —————,

1000∙1000

 

где а – содержание сиаловых кислот в исследуемой пробе в мкг, найденное по калибровочному графику;

5 – расчет на 1 мл сыворотки;

1000 (в числителе) – для перевода на 1 л сыворотки;

1000 (в знаменателе) – для пересчета в мг и г.

Оформление работы. По полученным значениям экстинкций сделать расчет содержания сиаловых кислот в г/л. Пересчитать их содержание в ммоль/л согласно формуле:

 

а∙10³

Х = ————,

 

где а – количество сиаловых кислот в г/л;

10³ – перевод г в мг;

309 – молекулярный вес сиаловых кислот.

Практическое значение работы. В норме содержание сиаловых кислот в сыворотке крови колеблется от 2,0 до 2,36 ммоль/л (0,62-0,73 г/л). Их количество значительно возрастает при заболеваниях, связанных с деструкцией соединительной ткани, при туберкулезе, инфаркте миокарда, опухоли головного мозга. Снижение содержания отмечается при пернициозной анемии, болезни Вильсона, дегенеративных процессах центральной нервной системы.