Реакция иммунофлюоресценции (риф)

Реакция иммунофлюоресценции — РИФ (метод Кунса). Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов вирусов. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены вирусов, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген (вирус) - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом.

РАДИОИММУНЫЙ АНАЛИЗ (РИА)

Радиоиммунный анализ(РИА) -высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген - антитело с применением антигенов или антител, меченных радиоизотопом (^125J, ^14С, Н,^51Сrи др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Методы генетической идентификации вирусов

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет обнаружить вирус в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию в нем ДНК или РНК вируса без выделения последнего в чистой культуре. Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного вируса гена. ПЦР основан на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют (“расплетают” при нагревании) и достраивают, при охлаждении, к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити, в результате чего из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких однонитевых ДНК, комплементарных 3’-концам ДНК искомого гена), ДНК-полимеразы и нуклеотидов. А в случае с РНК-содержащими вирусами на первом этапе осуществляется синтез ДНК на матрице геномной РНК (обратная транскрипция при участии фермента ревертазы), далее процесс амплификации (накопления) происходит по вышеописанной схеме.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ (МГ)

Позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения. Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90°C) в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10°C вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда. Зондом называется одноцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, меченая радиоактивными нуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК. Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют в специальным фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий радиоактивный зонд. Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образуют между собой двойную спираль.

III. План практической работы

1. Учесть и зарисовать раннюю реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) в диагностике гриппа (см. механизм реакции в базовом тексте).

Метод диагностики: вирусологический

Компоненты: типоспецифические противогриппозные сыворотки (содержащие антитела к вирусам гриппа А, А1, А2 и В), исследуемый материал (вирус гриппа, культивированный в тканевых культурах), изотонический раствор хлорида натрия, 1% суспензия куриных эритроцитов.

Постановка: Разведение соответствующих типоспецифических противогриппозных сывороток в ряде лунок, используя 0,9% раствор NaCl (см. разведения на планшетке). В каждую лунку вносят по 0,2 мл исследуемого вируса. Выдерживают 60 мин. при комнатной температуре. Затем в каждую лунку вносят по 0,4 мл. 1% суспензии куриных эритроцитов. Инкубация в течение 2-х часов при температуре 37 °C.

Учет: Положительная реакция «+» – осадок с ровными краями в виде красной пуговки. Отрицательная реакция «-» - осадок с неровными краями в виде красного зонтика. Титр РТГА определяют по максимальному разведению, при котором наблюдается торможение гемагглютинация (красная пуговка).

Заключение: Вирусологический материал содержит вирус гриппа А2 в титре 1/320.

2. Учесть и зарисовать реакцию нейтрализации в диагностике полиомиелита по цветной пробе (см. механизм реакции в базовом тексте).

Метод диагностики: вирусологический

Компоненты: типоспецифические полиомиелитные сыворотки (содержащие антитела к вирусу полиомиелита типа 1, 2, 3), исследуемый материал (вирус гриппа, культивированный в тканевых культурах), культура клеток в питательной среде №199 и индикатор pH среды.

Постановка: Вируссодержащий материал смешиваетсяс соответствующими типоспецифическими полиомиелитными сыворотками в 3-х пробирках. Оставляется на 1 час при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку с культурой клеток в питательной среде №199 с индикатором pH среды вносят смесь вируса с диагностической сывороткой. Инкубация в течение 4-9 дней при температуре 37 °C.

Учет: Положительная реакция «+»– пробирка с желтой средой (вирус нейтрализовался типоспецифической сывороткой, а клетки остались жизнеспособными, вырабатывающими кислые продукты метаболизма, изменяющие pH среды в кислую сторону, при этом цвет жидкости меняется с красного на желтый). Отрицательная реакция «-» - пробирка с красной средой (реакции нейтрализации не произошло).

Заключение: Вирусологический материал содержит вирус полиомиелита типа ­I.

3. Учесть и зарисовать ИФА в диагностике ВИЧ-инфекции (см. схему твердофазной ИФА в базовом тексте)

Ингредиенты реакции: исследуемая сыворотка для выявления антител к поверхностным антигенам (гликопротеинам) ВИЧ,лунки планшеток с сорбированным ВИЧ антигеном , антиглобулиновая сыворотка, меченая ферментом (пероксидазой хрена) и субстрат/хромоген для фермента (перекись водорода + ортофенилендиамин - ОФД)

Постановка ИФА: В лунки планшетокс сорбированным ВИЧ антигеном добавляют исследуемую сыворотку больного. Выдерживают 60 мин. при комнатной температуре и промывают каждую лунку буферным раствором для удаления несвязанных компонентов. В каждую лунку вносят антиглобулиновую сыворотку, меченую ферментом (пероксидазой хрена). Выдерживают 60 мин при комнатной температуре и промывают каждую лунку буферным раствором для удаления несвязанных компонентов. Затем добавляют субстрат/хромоген для фермента (перекись водорода + ортофенилендиамин - ОФД).

Учёт ИФА. При образовании комплекса + + , субстрат (перекись водорода) расщепляется ферментом (пероксидазой хрена) на конечные продукты кислород и воду. В присутствии кислорода индикатор (ОФД) изменяет цвет продукта реакции — с бесцветного на желто-коричневый. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Определяют оптическую плотность содержимого каждой лунки (контрольных и рабочих) с помощью фотоколориметра.

1. Определение специфичности контролей: контроли специфичны, если

ОП «+» контролей >1, а ОП «-»<0,2.

2. Расчет ОП критической

ОП крит. = ср. знач. ОП К^- + 0,200

где ОП крит.- критическое значение оптической плотности; ср. знач. ОП К^--- среднее значение оптической плотности отрицательных контролей; 0,200 – коэффициент, устанавливаемый методом статистической обработки результатов на предприятии-изготовителе тест-системы.

3. Определение результата реакции:

результат положительный, если ОП рабочей лунки > ОП крит.,

результат отрицательный, если ОП рабочей лунки < ОП крит.

Заключение: Например, контроли специфичны и результат положительный, следовательно, в исследуемой сыворотке содержатся антитела к ВИЧ.

4. Зарисовать схему молекулярной гибридизации (МГ)

Метод молекулярной гибридизации ДНК-ДНК используется для установления геномного родства в пределах рода и семейств микроорганизмов; РНК-ДНК на уровне порядка. Степень сходства или гомологичность последовательностей ДНК выражается процентом (%) гомологии и является мерой геномного родства микроорганизмов.

Схема точечной гибридизации

1. ДНК наиболее типичного штамма метится изотопом ³H тритием или ³²P фосфором
2. Фрагментация и денатурация меченой ДНК
3. Исследуемая ДНК денатурируется, но не фрагментируется и иммобилизуется на твердой фазе, например на гранулированном агаре, мембранных фильтрах (нитроцеллюлозные или нейлоновые)
4. Инкубация исследуемой ДНК с меченой ДНК в жидкой среде. При гомологии фрагменты меченой гибридизируются с исследуемой, т.е. формируется двунитчатая структура
5. Для повышения точности метода применяют обработку гибридов специфическим ферментом – нуклеазой S₁, которая способна «отсеивать» от гибридных дублексов непрореагировавшие одноцепочечные участки
6. Отделение гибридов с помощью гидроксиаппатита, т.е. отмывка гибридов от балластного материала
7. Подсчет радиактивности на счетчиках с определением % гомологии ДНК

Недостаток метода - короткий период полураспада фосфора и наличие специфического оборудования.

Блот-гибридизация

Метод выявления фрагментов ДНК, разделенных электрофорезом в агарозе. ДНК предварительно нарезается с помощью рестрикционных эндонуклеаз из суммарной ДНК. Перенос фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные фильтры и обработка мечеными зондами.

Гибридизация in situ

Позволяет выявить нуклеиновые кислоты в инфицированных клетках. Клетки, после денатурации нуклеиновой кислоты, обрабатываются немечеными зондами, формирующими гибридные двунитчатые структуры, затем обработка меченой флюорохромом сывороткой к гибридомам. При наличие в материале незначительных количеств нуклеиновой кислоты вирусов применяется ПЦР.

5. Зарисовать схему постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) (см. базовый текст)