Дослід 3. Дослідження впливу рН середовища на активність амілази слини.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності крохмалю при взаємодії з йодом утворювати синє забарвлення за умов оптимального для амілази рН середовища. Продукт розщеплення крохмалю – мальтоза – з йодом забарвлення не дає і її можна виявити за допомогою проби Тромера.

Матеріальне забезпечення: 0,5 % р-н крохмалю, 0,1 н розчин I₂ в KI, 10% р-н NaOH, 5 % р-н CuSO₄, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У три пробірки вносять по 2 мл 0,5 %-го р-ну крохмалю. У першу додають 2 мл фосфатного буферу з рН 5,0, у другу – з рН 7, а в третю – з рН 9. В кожну з пробірок вносять по 1 мл розведеної слини і поміщають їх у водяну баню при температурі 37^°С.

Після інкубації вміст кожної пробірки ділять порівну. До перших фракцій додають по 3-5 крапель р-ну І₂ в KI і спостерігають за зміною забарвлення. З фракціями, що залишилися, проводять пробу Тромера (див. дослід № 1).

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

 

Дослід 4. Кількісне визначення активності амілази сечі за методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута ґрунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість ферменту, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1 % розчину крохмалю. Цю кількість ферменту приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазну активність виражають в кількості мл 0,1 % розчину крохмалю, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл нерозведеної сечі при температурі 45^оС впродовж 15 хв.

Матеріальне забезпечення: сеча, 0,1 % р-н крохмалю, 0,1 % розчин I₂ в 0,2 % розчині KI, 0,85 % р-н NaCl, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У дев’ять пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл 0,85 % р-н NaCl. У першу пробірку додають 1 мл сечі. Вміст добре перемішують і 1 мл з отриманого розчину першої пробірки переносять в другу, з неї – в третю, тощо. Таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту в два рази менший, ніж у попередній. З останньої пробірки 1 мл суміші виливають для зрівняння об’єму. Потім в усі пробірки додають ще по 1 мл 0,85% р-ну NaCl та по 2 мл 0,1% розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки у водяну баню (чи термостат) при 45°С на 15 хв.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0,1% розчин йоду в 0,2 % розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина в пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій кольори. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності в сечі:

Показник	№ пробірки
Розведення сечі
Кількість 0,1 % розчину крохмалю, мл
Забарвлення після додавання йоду
Остання пробірка жовтого кольору

 

Для розрахунку активності амілази необхідно знати розведення сечі в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою (у ній сеча розведена у 16 разів). Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/16 мл сечі розщеплює 2 мл 0,1 % розчину крохмалю;

1мл сечі розщеплює - Х мл 0,1 % розчину крохмалю,

А отже: А (амілазна активність) = 32 одиниці.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовують в клінічній практиці для визначення амілазної активності в крові та сечі. У нормі активність амілази сечі коливається в межах 16-18 одиниць. При гострих панкреатитах активність амілази сечі та сироватки крові зростає в 10-30 разів, особливо впродовж першої доби захворювання, потім поступово повертається до норми.