Периодическое и непрерывное культивирование.

 

Периодическое культивирование - рост микроорганизмов (м/о) в жидкой среде в закрытом сосуде определенного объема, то есть в закрытой системе. При этом м/о проходят несколько стадий роста:

 

1. Лаг-фаза:

● “привыкание” к среде

● индукция ферментов

● увеличение количества ДНК и РНК

● стадию можно удлинить, если переносить старый посевной материал на новую среду того же состава и той же температуры

● при смеси субстратов наблюдается диауксия, то есть как бы две лаг-вазы, двустадийное привыкание:

Экспоненциальный рост

● “логарифмическая”фаза

● максимальная скорость роста, неограниченный рост

● такие клетки используют в биохимических и физиологических исследованиях

● самые быстрорастущие - фотобактерии,время удвоения - 8 минут, E.coli - 20 минут.

● константа скорости (мю): зависит от условий выращивания

Фаза замедленного роста

● исчерпание субстрата

● снижение скорости роста

● накопление продуктов обмена

4. Стационарная фаза, “плато”

● динамическое равновесие процессов отмирания и деления клеток

● для бактерий фаза достигается при концентрации в среднем 10^9 клеток/мл, для водорослей и простейших - 10^6 кл/мл

Фаза отмирания

● преодоление некой пороговой концентрации накопленных продуктов и исчерпание питательных веществ

● логарифмический характер.

 

Математика, которую точно спросят:

 

N-количество клеток.

При экспоненциальном росте оно увеличивается по геометрической прогрессии, то есть:

Nt = N0*2^n, где N0-начальное количество клеток, n - число делений.

Логарифмируем:

lgN1=lgNo +n*lg2

n=(lgNt - lgN0)/lg2

Тогда константа скорости деления клеток:

V = n/t = (lgNt - lgN0)/lg2(t-t0),

а время регенерации:

g=t/n=1/V

Будем рассматривать популяцию не как набор индивидуумов, а как систему, тогда скорость изменения плотности такой системы пропорциональна самой плотности, т.е. изменение следует кинетике реакций первого порядка:

(мю)=1/N * dN/dt

Интегрируем:

N=N0*e^( t)

После удвоения числа клеток:

2N0=N0*e^( t)

2=e^( t)

Логарифмируем:

ln2= t_d

Откуда время удвоения:

t_d=ln2/ =g=1/V и =V*ln2

Подставим V, выраженное через количество клеток, и перейдя к десятичным логарифмам, получим:

V = n*t = (lgNt - lgN0)/lg2(t-t0)

=(lgN - lgN )/lge(t-t0)=(lgNt - lgN0)/0,4343(t-t0)

 

Под выходом, или урожаем биомассы, понимают разницу между максимальной массой клеток и исходной:

X=Xmax-X0.

Применяют так же энергетический коэффициент, г/моль:

Y(ATP)=X/ATP

 

Иногда необходимо синхронное деление клеток, для этого используется:

● фильтрация или дифференцированное центрифугирование для получения клеток одного размера

● резкое изменение температуры инкубации

● воздействие света

● и т.д.

В этом случае кривая роста - ступенчатая. Причем синхронизировать обычно удается не более трех делений, а потом колония снова переходит к асинхронному делению:

Непрерывное, или проточное, культивирование - система культивирования, позволяющая зафиксировать колонию в одной фазе, при этом состав среды и условия роста остаются постоянными.

 

Суть выращивания в том, что среда пополняется пропорционально росту клеток, так же происходит отток части суспензии.

Два типа непрерывных культур:

1. Хемостат - фиксируется химический параметр (например, концентрация субстрата или кислорода), который является лимитирующим.

Скорость разбавления:

D=f/V, где f-скорость притока, а V - объем сосуда.

Если бы бактерии не росли, то скорость вымывания была бы:

D =-dx/dt

Плотность бактериальной суспензии снижалась бы экспоненциально:

x=x0*e^(-Dt)

Но бактерии растут экспоненциально:

x=x0*e^( t)

При этом скорость прироста:

(x)=dx/dt

Следовательно, скорость изменения плотности суспензии:

dx/dt= (x)-D

Зависимость константы скорости роста от концентрации субстрата C описывается кривой насыщения:

= max* C /(K +C )

Если истинная констант вследствие лимитации по субстрату окажется меньше максимальной, то скорость разбавления можно менять в широких пределах, не опасаясь, что это приведет к снижению плотности суспензии, однако D не должно превышать max.

Уже при достаточно небольших концентрациях субстрата бактерии растут с достаточно высокой скоростью, а если C велико, то стремится к max.

 

Первый график - оптическая плотность от времени, второй - концентрация субстрата от времени:

 

2. Турбидостат - поддержание плотности бактериальной суспензии. Фотоэлемент меряет плотность и в зависимости от этого меняется подача и отток. Основная проблема этого культивирования - пристеночное обрастание.