Культивирование и рост микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов проводится с целью увеличить кол-во материала (работа с популяцией микроорганизмов).

Накопительные культуры:

Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают предста­вители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганиз­мов (за счет накопления определенной группы в селективных условиях, где другие группы либо не размножаются, либо характеризуются незначительным ростом). Специфические питательные сре­ды, удовлетворяющие потребности преимущественно одной группы микроор­ганизмов- элективные=селективные (среда Эшби является элективной для рода Azotobacter).

 

Чистые культуры:

Она может быть получена из отдельной колонии или одной клетки (клетки одного вида).

Посев по Коху: накопитель­ную культуру высевают на поверхность плотной среды.

Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную и охлажденную до 50 питательную среду, содержащую агар или желатину, в сте­рильные чашки Петри. После застывания на поверхность наносят каплю культуры и растирают шпателем, потом этим же шпателем растирают в 2-й,3-й,4-й чашках.

Так же можно посеять истощающим способом петлей (как сеяли на практикуме, делим на сектора чашку, и захватывая одну линию траектории, размазываем по секторам. Перед каждым размазыванием петлю прожигают

После посева в термостат крышками вниз, чтобы конденсат не закапал среду.

Выросшие изолированные колонии отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды в пробирке или в жидкую среду.

 

Типы сред:

1). По физическому состоянию могут быть

● жидкими, применяют для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, накопления биомас­сы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорга­низмов, плохо развивающихся на плотных средах.

● полужидкими, реды получают добавлением к жидким средам 0,5 % агара и используют для специальных це­лей, например культивирования анаэробных микроорганизмов.

● твер­дыми (плотными) Они необходимы для выделе­ния чистых культур микроорганизмов, в диагностических целях, для количе­ственного учета микроорганизмов, хранения культур и в ряде других случаев.

● сыпучими.(Стан­дартность, простота хранения, транспортировки и изготовления делают их весьма удобными для работы).

2). по химическому составу:

На мономерах, к.пр., нельзя создать селективную среду, на части полимеров тоже (крахмал, большая часть белков); хитин, коллаген-селективны. В среде должны присутствовать необходимые питательные вещества: фосфаты, различные макро- и микроэлементы (Cl,K,Na,Ca,Mg,Fe,…).

Стандартная неселективная среда – БСА: мясо-пептонный бульон (МПБ) и неохмеленное пивное сусло с концентрацией сахара 4град. (в соотношении 1:1) с 2% агара.

Для создания селективных условий необходимо добавление в среду специфических веществ, например, при выращивании азотфиксаторов, не нужно добавлять азот (=> вырастут те, кто умеет улавливать его из воздуха); нитрификаторы – NH₄,NO₂; денитрификаторы – NO₃; сероокисляющие бактерии- S; сульфатредукторы – сульфаты; серные бактерии – H₂S, …

 

Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов:

1)Аэробные:

На поверхности жидких и плотных сред — поверхностное культивирование или внутри жидкой питательной среды — глубинное культиви­рование. При поверхностном культивировании кислород в клетки из воздуха, использовать ч петри или колбы Виноградова.

При глубинном культивировании среду надо аэрировать

При аэрации два показателя: интенсивность и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кис­лорода в единице объема культуральной жидкости за единицу времени. Сте­пень аэрации — это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за единицу времени.

Наиболее простой и широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования — выращивание на качалках+отбойники в колбах

2) Анаэробные микроорганизмы:

более сложно, чем культи­вирование аэробов, так как соприкосновение клеток анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено.

Выращивание в высоком слое среды.

Метод культивирования в вязких средах. Вязкость сред легко увели­чить добавлением к ним 0,2— 0,3 % агара.

Для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении их численности анаэробные микроорганизмы выращивают в толще питательной среды.

Анаэробные микроорганизмы можно выращивать в анаэростатах — ваку­умных металлических камерах, снабженных манометром.

Метод Хангейта:

Культивирование строгих анаэробов.

1) все процедуры — приготовление и разлив сред, посевы, культивирование микроорганизмов и т.д., проводят с максимальной защищенностью от контакта с кислородом (анаэробный бокс, кипячение, работа в токе стерильного газа, использование герметически закрытых сосудов и т.д.);

2) до посева микроорганизмов в среды добавляют восстановители (цистеин, сульфид натрия, тиогликолат в щелочной среде) для химического поглощения следов кисло­рода, диффундирующего в сосуды для культивирования даже через резиновые пробки;

3) все пересевы и добавки в среды проводят с помощью шприцев, проду­тых газом, не содержащим кислород;

4) все трубки и шланги, используемые для пропускания газа, должны быть изготовлены из материала, не допускающего (медь) или допускающего в слабой степени диффузию сквозь него кислорода воздуха (бутилированная резина).

В качестве поглотителя кислорода из газов в лабораторной практике используют щелочные растворы пирогаллола или дитионита натрия, металлическое железо, медь, нагретую до 400 °С, или некоторые другие реактивы.

Для удаления следов кислорода из промышленных газов, которые поставляют в баллонах, содержащих до 1,5 % воздуха, используют следующую процедуру: газ про­пускают через стеклянную трубку, заполненную медными стружками и нагретую до 400 °С с помощью электронагревателя.