Мультиплексный фосфоресцентный микроанализ

Современные тенденции в развитии методов лабораторной диагностики инфекций связаны с повышением не только чувствительности и специфичности, но и мультиплексности разрабатываемых тестов, то есть возможности одновременного определения нескольких маркеров в одной пробе без разделения последней на отдельные порции. Создание таких тестов является актуальным в связи с существованием «сочетанных» природных очагов и «смешанных» инфекций и составляет основу разработки комплексного подхода к одновременному выявлению всего спектра потенциально возможных заболеваний при проведении скрининговых сероэпидемиологических исследований эндемичных территорий. Для реализации такого подхода возможно использование диагностической технологии на основе фосфоресцентного мультикомпонентного микроанализа (ФОСФАН). В настоящее время разработана биочип-технология ФОСФАН для индикации возбудителей особо опасных инфекций (рис. 20).

 

Рис. 20. Фосфоресцентный микроанализатор ФОСФАН

 

В отличие от иммуночипов, формируемых на стекле, предлагаемый подход позволяет одновременно анализировать до 96 образцов и использовать для анализа стандартное оборудование (шейкеры, промыватели и т.п.). Комплект состоит из индикатора фосфоресценции (ИФИС), укладки для отбора проб и набора реагентов (тест-систем) для обнаружения и идентификации возбудителей сибирской язвы, чумы, туляремии, венесуэльского энцефаломиелита лошадей, заболеваний ортопоксвирусной природы, Крымской геморрагической лихорадки, сыпного тифа, клещевой пятнистой лихорадки, токсинов ботулинического типа А и стафилококкового типа В. Принцип построения индикационных тестов универсален. На твердой фазе дна лунки полистиролового микропланшета сорбируют в виде отдельных микрозон специфические АТ. Формирование микрозон осуществляется контактным способом с помощью роботизированных наноплоттеров. Стадии анализа включают инкубацию анализируемой пробы в лунках микропланшета, промывку лунок для удаления не связавшихся компонентов реакции, биоспецифическое связывание выявляемого в пробе патогена или его АГ с индикаторными АТ, конъюгированными с биотином. «Проявление» реакции осуществляют с помощью универсального фосфоресцирующего реагента - конъюгата стрептавидина с Pt копропорфирином. Сигнал фосфоресценции регистрируют при последовательном сканировании отдельных участков дна лунки микропланшета светодиодом с длиной волны излучения 380 нм. Чувствительность системы детекции составляет около 10^б молекул Pt копропорфирина в освечиваемой площадке сканирования диаметром около 1 мм. Результаты сканирования регистрируют как число фотоимпульсов от каждой из микрозон. После компьютерной обработки графическая картина распределения сигнала в микрозонах представляется в виде объемных цветных гистограмм или окрашенных пятен. Интенсивность сигнала в виде цветовой шкалы отражает концентрацию патогена в исследуемой микрозоне.

В ходе анализа обеспечиваются требования противоэпидемического режима. Индикатор фосфоресценции размещается в боксированной зоне и управляется радиосвязью через персональный компьютер. После завершения иммунной реакции адсорбированный биоматериал сохраняет стабильный уровень фосфоресценции в течение нескольких месяцев. Это позволяет архивировать микропланшеты и, при необходимости, осуществлять повторное измерение сигнала. Технология ФОСФАН сочетает преимущества твердофазного микропланшетного сэндвич-иммуноанализа с потенциалом биочип-технологий. По сравнению с классическими схемами твердофазного ИФА она имеет ряд очевидных преимуществ благодаря возможности осуществления мультикомпонентного анализа. Микропланшетный формат выгодно отличает ее и от традиционных биочип-технологий на слайдах. Это обусловлено более благоприятными условиями для дозирования проб и реагентов и, как следствие, возможностью создания количественных тестов и многократного повышения производительности лабораторных исследований. Следует также добавить ряд важных экономических моментов, создающих очевидные конкурентные преимущества для данной технологии: уменьшение расхода АТ, используемых для сорбции на твердой фазе (почти в 100 раз); снижение расхода иммунореагентов (конъюгатов, биотинилированных АТ и стрептавидина) в 5-10 раз за счет обработки только дна лунок микропланшета. Благодаря высокой стабильности фосфоресцентной метки, дополнительным преимуществом метода является возможность отсроченного и (или) повторного измерения результатов анализа биоматериала в высушенных и герметично упакованных планшетах, которые могут храниться в архиве в течение длительного периода времени (месяцев, лет).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЗАНЯТИЯ

Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)

Сэндвич-вариант ИФА для обнаружения АГ

Принцип метода. Взаимодействие АГ с AT, меченым ферментом. Учет реакции осуществляется измерением ферментативной активности реакционной смеси, что дает возможность оценить количество искомого АГ в исследуемых образцах. Высокая чувствительность ИФА связана с каталитическими свойствами ферментов, одна молекула которых может реагировать с большим количеством (несколько тысяч) молекул субстрата.

Реактивы: а) 0,05 М КББ рН 9,6: 5,25 г Nа₂СОз и 4,2 г NaHCO₃ доводят дистиллированной водой до объема 1 л. На 1 л NaHCO₃ требуется 300 мл Nа₂СO₃. Хранят в холоде не более 2 недель.

б) ЗФР рН 7,2: 8 г NaCl, 0,2 г КН₂РO₄, 0,2 г КС1 и 2,9 г Na₂HPO₄ ·12Н₂O растворяют в 1 л дистиллированной воды, рН доводят КН₂РО₄.

в) Отмывающий раствор: к 100 мл ЗФР рН 7,2 добавляют 50 мкл Твина-20.

г) 1 %-ный БСА: в 100 мл ЗФР рН 7,2 растворяют 1 г БСА

д) Субстрат: 10 мг дианизидина или диаминобензидина растворяют в 1 мл метанола, добавляют последовательно 99 мл дистиллированной воды и 0,1 мл 3% перекиси водорода. Раствор должен оставаться прозрачным. Готовить в химически чистой посуде!

е) Стоп-реагент- 3 %-ный азид натрия: В 100 мл дистиллированной воды растворяют 3 г азида натрия.

Материал для исследования в ИФА обрабатывается так же, как для гемагглютинационных методов исследования.

Техника проведения анализа: Подготовка твердой фазы: в каждую лунку двух вертикальных рядов микропланшета вносят по100 мкл специфического к искомому АГ иммуноглобулина концентрацией 50 мкг/мл в 0,05 М КББ рН 9,6, закрывают крышкой и помещают в термостат при 37 °С на 2-3 ч, либо на 16-18 ч в холодильник при 4 °С. Перед постановкой реакции раствор АТ из лунок сливают в дез. раствор и трижды отмывают ЗФР-тв, оставляя отмывающий раствор в лунках каждый раз на 2-3 мин. После заключительного отмывания микропланшет встряхивают для избавления от капелек отмывающей жидкости и слегка подсушивают на воздухе. Далее в сенсибилизированные антителом лунки вносят по 100 мкл 1 %-ного раствора БСА для забивки возможных оставшихся свободных участков на твердой фазе, выдерживают 30 мин при 37 °С, после чего планшет освобождают от раствора инертного белка и трижды промывают ЗФР-тв. Отмывающую жидкость удаляют, в каждую подготовленную лунку вносят по 100 мкл ЗФР-тв, затем в 3-ю лунку первого вертикального ряда добавляют 100 мкл исследуемого материала и титруют в объеме 100 мкл, перенося из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д. до 7 лунки второго вертикального ряда включительно, из которой 100 мкл раствора раститрованного АГ удаляют в дез. раствор. 8 лунка второго вертикального ряда – положительный контроль - заведомо известное количество положительного АГ. Первые две лунки первого вертикального ряда – отрицательный контроль - гетерологичный АГ, либо суспензия органов от здоровых животных, или иной материал, не содержащий специфический АГ. После часовой инкубации при 37 °С содержимое лунок удаляют в дез.раствор и трижды отмывают ЗФР-тв, как сказано ранее. Затем во все лунки добавляют по 100 мкл рабочего разведения раствора конъюгата (специфические АТ=Фермент). Инкубируют 1 ч при 37 °С, трижды отмывают ЗФР-тв. После заключительного отмывания в каждую лунку вносят по 100 мкл раствора субстрата. Реакцию проводят 15-30 мин при комнатной температуре, после чего в каждую лунку добавляют по 1 капле стоп-реагента. При положительном результате в лунках развивается оранжево-коричневое окрашивание. В отрицательном – раствор прозрачен.

Непрямой вариант ИФА для обнаружения АТ

Техника проведения анализа: Подготовка твердой фазы: в каждую лунку двух вертикальных рядов микропланшета вносят по100 мкл раствора АГ концентрацией 50 мкг/мл в 0,05 М КББ рН 9,6, закрывают крышкой и помещают в термостат при 37 °С на 2-3 ч, либо на 16-18 ч в холодильник при 4 °С. Перед постановкой реакции раствор АГ из лунок удаляют в дез. раствор и трижды отмывают ЗФР-тв, оставляя отмывающий раствор в лунках каждый раз на 2-3 мин. После заключительного отмывания микропланшет встряхивают для избавления от капелек отмывающей жидкости и слегка подсушивают на воздухе. Далее в сенсибилизированные антигеном лунки вносят по 100 мкл 1 %-ного раствора БСА для забивки возможных оставшихся свободных участков на твердой фазе, выдерживают 30 мин при 37 °С, после чего планшет освобождают от раствора инертного белка и трижды промывают ЗФР-тв. Отмывающую жидкость удаляют, в каждую подготовленную лунку вносят по 100 мкл ЗФР-тв, затем в 3-ю лунку первого вертикального ряда добавляют 100 мкл исследуемой сыворотки (разведенной заранее ЗФР-тв 1:100) и титруют в объеме 100 мкл, перенося из 1-ой лунки во 2-ю, из 2-ой в 3-ю и т.д. до 7 лунки второго вертикального ряда включительно, из которой 100 мкл раствора раститрованной сыворотки удаляют в дез. раствор. 8 лунка второго вертикального ряда – положительный контроль - заведомо положительная сыворотка больного человека или животного. Первые две лунки первого вертикального ряда – отрицательный контроль - гетерологичная сыворотка, либо сыворотка от здоровых животных или человека. После часовой инкубации при 37 °С содержимое лунок удаляют в дез.раствор и трижды отмывают ЗФР-тв, как сказано ранее. Затем во все лунки добавляют по 100 мкл рабочего разведения раствора конъюгата (антивидовые АТ=Фермент). Инкубируют 1 ч при 37 °С, трижды отмывают ЗФР-тв. После заключительного отмывания в каждую лунку вносят по 100 мкл раствора субстрата. Реакцию проводят 15-30 мин при комнатной температуре, после чего в каждую лунку добавляют по 1 капле стоп-реагента. При положительном результате в лунках развивается оранжево-коричневое окрашивание. В отрицательном – раствор прозрачен.

Учет и оценка результатов ИФА: Учет результатов реакции можно проводить визуально и инструментально (с помощью ИФА-ридера). Визуально реакцию учитывают по наличию соответствующего окрашивания содержимого лунок в опытных пробах и положительном контроле и отсутствию такового в отрицательных контролях. При наличии слабого окрашивания в отрицательных контрольных образцах (что иногда имеет место при технических погрешностях: некачественной отмывке лунок планшета, использовании концентрированного раствора конъюгата, загрязнении субстрата и т. д.) реакцию учитывают по разнице в окраске отрицательных контрольных и опытных проб.

Инструментальный учет результатов реакции осуществляют на ИФА - ридерах, определяя оптическую плотность продукта реакции фермент-субстрат при соответствующей длине волны. Оптическая плотность положительных образцов должна как минимум в 1,5 - 2 раза превышать таковую в контрольных пробах.