Определение аминного азота формольным титрованием по упрощенному методу зеренсена-гаврилова.

Белковые гидролизаты представляют собой смесь аминокислот и простейших пептидов. Сырьем для получения гидролизатов могут служить любые полноценные по аминокислотному составу природные белки. В зависимости от сырья все белковые гидролизаты подразделяются на три группы: гидролизаты из крови и ее составных частей, из казеина, из растительных белков.

Гидролиз белка можно осуществить тремя путями: действием протеолитических ферментов (трипсин, пепсин, папаин), кислот и щелочей. В зависимости от условий гидролиз доводят до полного расщепления белка на аминокислоты или часть его сохраняют на пептиды.

Как известно, расщепление белков в организме до простейших пептидов и аминокислот происходит под действием ферментов пищеварительных соков. Аналогичное расщепление белка возможно и вне организма. Для этого к белковому субстрату (кровь, плазма, сыворотка крови и др.) добавляют ткани поджелудочной железы и слизистую оболочку кишечника, желудочный сок или чистые ферменты – пепсин, трипсин, папаин. Затем смесь помещают в термостат на несколько дней, и белки расщепляются до пептидов и аминокислот. Этот способ расщепления белка называется ферментативным, а полученный при этом раствор - ферментативным гидролизатом. Преимущество ферментативного гидролиза заключается в том, что аминокислоты не разрушаются и не происходит их рацемизация. Недостатками метода является сравнительно медленное течение гидролиза, возможность попадания в гидролизат продуктов расщепления самих протеолитических энзимов и возможность загрязнения препарата бактериями.

Гидролиз может происходить при кипячении белков в растворах кислот – кислотный гидролиз. Кислотный метод гидролиза прост и исключает возможность бактериального загрязнения среды. Его недостатки: в процессе гидролиза может разрушиться одна из аминокислот – триптофан, в более слабой степени окисляются треонин и серин. Кроме того, при кислотном гидролизе белков крови, содержащих углеводы, образуются побочные продукты – гумины. Некоторые из них оказывают неблагоприятный биологический эффект.

Химический гидролиз белка является более жестким процессом, как правило, требующим высоких температур и, сравнительно непродолжительного времени. Он осуществляется с помощью кислот и щелочей. Однако расщепление белка с помощью щелочей мало приемлемо в связи с тем, что при таком виде гидролиза разрушается большая часть диаминокислот, интенсивно разлагаются, взаимопревращаются и рацемизируются другие аминокислоты, например, оксиаминокислоты, цистеин.

При кислотном гидролизе тоже имеет место частичное разрушение некоторых аминокислот, но весьма незначительное, позволяющее в основном иметь представление о составе и характере промежуточных продуктов молекулы белка. В первую очередь, при кислотном расщеплении белка подвергается разрушению триптофан, причем интенсивность разрушения этой аминокислоты связана с наличием примеси углеводов и металлов в гидролизуемом белке. Считают, что триптофан превращается в дикарбоновую аминокислоту, а продукты разрушения триптофана – индоловые ядра, конденсируясь с альдегидами, образуют гуминовые вещества.

При кислотном гидролизе также подвергаются частичному разрушению серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик.

В зависимости от избранной концентрации кислоты и длительности ее воздействия на белок интенсивность гидролиза будет протекать различно.

Помимо пептидов в процессе расщепления белка образуется множество других веществ. В состав белкового материала почти всегда входят углеводы, которые также как и белок подвергаются гидролизу и образуют продукты распада; свободные аминокислоты и продукты их окисления, а также продукты вторичной конденсации аминокислот и сахаридов еще более усложняют состав гидролизата.

Соблюдение определенного температурного режима при гидролизе белка позволяет уменьшить дезаминирование оксиаминокислот, хотя в общем-то распад этих аминокислот невелик.

Разрыв пептидных связей при гидролизе белка не является беспорядочным процессом, а происходит в определенных местах и носит закономерный характер. Пептидные связи, образованные оксиаминокислотами при кислотном гидролизе, менее стойки и раскрываются раньше, чем пептидные связи, образованные другимим аминокислотами.

Выбор метода гидролиза для получения лечебного препарата является существенным моментом.

На первый взгляд расщепление белка с помощью ферментов является более приемлемым, поскольку оно соответствует условиям пищеварения в желудочно-кишечном тракте. При расщеплении белка ферментативным путем нет опасности разрушения аминокислот. Вместе с тем, ферментативный гидролиз таит в себе возможность бактериального загрязнения. Температура, оптимальная для действия ферментов (37-78*C), является наиболее благоприятной и для жизнедеятельности микроорганизмов, особенно если учесть, что в некоторых случаях вместо ферментов пользуются поджелудочной железой и слизистой тонкой кишки, взятыми у животных в момент убоя.

Кроме того, конечный продукт ферментативного гидролиза может быть загрязнен примесями чужеродного белка, каковым является сам фермент.

Расщепление белка с помощью минеральных кислот, с этой точки зрения более приемлемо. Кислая среда в сочетании с высокой температурой полностью устраняет возможность бактериального загрязнения гидролизуемой смеси. Это обстоятельство является особенно существенным в том случае, когда дело идет о массовой заготовке белковых гидролизатов в производственных условиях.

Вместе с тем, кислотный гидролизат может быть получен таким образом, что он будет полноценным по аминокислотному составу. Разрушение некоторых аминокислот (триптофан), имеющее место при полном гидролизе белка, может быть сведено к минимуму, если избрать более мягкие условия гидролиза, вызывающие только частичное расщепление белка.

Белковые гидролизаты применяют при заболеваниях, протекающих с белковой недостаточностью, и при необходимости усиленного белкового питания, например, при заболеваниях желудочно-кишечного тракта с нарушениями всасывания белков, интоксикациях, ожоговой болезни, лучевой болезни и др., а также при невозможности питания через рот (например, после операций на пищеводе, желудке и т. п.) и для улучшения репаративных процессов в послеоперационном периоде.

Принцип метода.

Основан на блокировании формальдегидом при рН=7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

Реактивы: 1. Раствор 0,1 NNaOH;

2. Раствор 0,1 NHCl;

3. Формалин (40% раствор формальдегида). Перед каждым определением рН формалина доводят до 7,0.

Ход определения.

В химических стаканчик вносят 2 мл испытуемого раствора, прибавляют 18 мл дистиллированной воды и нейтрализуют в зависимости от рН раствора 0,1 NNaOH или 0,1 NHCl до рН=7,0. Вносят 2 мл раствора формольной смеси и титруют 0,1 NNaOH до рН=9,2.

По количеству миллилитра 0,1 NNaOH, пошедшему на титрование, определяется аминный азот в миллиграмм-процентах.

Расчет = А*1,4*100 = Х,

V

Где: А – количество миллилитров 0,1 NNaOH, пошедшим на титрование испытуемого раствора;

V – количество испытуемого раствора, взятого на титрование;

Х – количественное содержание аминного азота в миллиграмм-процентах;

1,4 – эквивалент азота, соответвущий 1 мл 0,1 NNaOH.

ЯИЧНЫЙ АЛЬБУМИН

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА