Опыт 13. Изучение участия пиридиннуклеотидов в биохимических реакциях окисления-восстановления.

Теоретическое введение. Пиридиннуклеотиды, входящие в качестве коферментов в состав более чем 150 так называемых «пиридинзависимых» дегидрогеназ, играют существенную роль в реакциях окисления-восстановления (главным образом, в процессе дыхания, т. е. в процессе переноса электронов от органических субстратов к молекулярному кислороду). Спектрофотометрическое определение восстановленных пиридиннуклеотидов служит в связи с этим одним из важных методов современной энзимологии.

В основе метода лежит существенное отличие спектров окисленной и восстановленной форм кофермента. Спектр поглощения окисленной формы — NAD⁺ имеет максимум при 260 нм. Для восстановленной формы — NADH характерен более длинноволновый максимум поглощения — при 340 нм. Измеряя в ходе окислительно-восстановительной реакции оптическую плотность объекта при 340 им, можно установить (зная коэффициент поглощения и длину кюветы) количество нуклеотида в пробе. С другой стороны, учитывая, что окисление-восстановление 1 мкмоля кофермента сопровождается восстановлением-окислением 1 мкмоля субстрата, этим же методом можно определить количество прореагировавшего субстрата.

Исследуемая реакция протекает по следующей схеме:

фермент

субстрат + NAD⁺ ---------------→ продукт реакции + NADH

Как правило, все компоненты, кроме определяемого, присутствуют в избытке. В расчетах исходят из величины коэффициента молярной экстинкции NADH: при окислении 1 мкмоль кофермента в 1 мл смеси оптическая плотность при 340 нм в кювете толщиной 1 см меняется на 6,22 ед. Количество определяемого вещества в пробе (в мкмолях) М рассчитывается по формуле:

 

где ∆D₃₄₀ — изменение оптической плотности смеси при 340 нм;

V — объем пробы (мл).

Энзиматический метод количественного определения

Принцип метода. NAD восстанавливается в присутствии этанола и алкогольдегидрогеназы. Количество образовавшегося NADH равно исходном количеств NAD+ и определяется спектрофотометрически:

При рН = 8,8 и концентрации спирта 0,5 М можно получить практически полное восстановление NAD+.

Реактивы.

1 Этанол 0,5 М, приготовленный на 0,1 М трис-буфере с рН= 10,1 (молекулярная масса этанола 46,07).

2. Алкогольдегидрогеназа: растворить в 1—2 мл дистиллята 1—2 мг белка непосредственно перед использованием. В случае использования суспензии учесть, что одной ферментной единицы (см. обозначения на упаковке белка) достаточно для полного превращения 1 мкмоля субстрата в
1 мин.

3. Раствор NAD+: 1—2 мл концентрации 1- 4 мМ; рН = 6,5 (молекулярная масса NAD+=633).

Процедура определения. В две спектрофотометрические кюветы помещают по 0,39 мл Н₂O (дистиллят); 2,5 мл раствора этанола 0,5 М на
0,1 М трис-буфере с рН—10,1 и 0,1 мл раствора NAD. В опытную кювету добавить 0,05 мл раствора алкогольдегидрогеназы, содержащего 1—2 мг белка в 1 мл.

Измеряют по точкам спектры поглощения растворов в опытной кювете и в контрольной для области 220—380 нм с шагом 5 нм. Учитывая поглощение контроля, оценивают ∆D340 в опытной кювете. Рассчитывают количество NADH в растворе и количество прореагировавшего NAD+. Последнюю величину сравнивают с исходной.

Спектры поглощения, снятые по точкам, необходимо представить в виде таблиц и графиков (ордината — D, абсцисса — λ в нм).

 

Практическое задание

1. Кофермент А принимает участие в качестве кофактора во многих ферментативных реакциях протекающих в организме человека и животных. Перепишите формулу кофермента А в тетрадь:

Карандашом обведите формулу пантотеновой кислоты в составе кофермента, также укажите в его составе аденин и рибозу.

2. В состав кофермента ФАД входит витамин рибофлавин. Перепишите в тетрадь формулу ФАД:

Карандашом обведите формулу рибофлавина.

3. Витамин никотинамид входит в состав кофермента НАД:

 

В тетрадь перепишите формулу НАД, карандашом обведите формулу витамина.

 

Вопросы для проверки полученных знаний

 

3. БИОЛОГИЧЕСКИ ВАЖНЫЕ ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ