Проба на белых мышах с парентеральным введением.

Для постановки этой биопробы также используют сконцентрированный экстракт корма. Сухой остаток растворяют в стерильном растительном масле и 0,5 мл его вводят подкожно белым мышам. При введении экстракта от резко токсичного корма мыши погибают через 6-12 часов. Общий срок наблюдений до 3 суток. Слабо токсичный корм вызывает развитие некроза на месте введения экстракта. В данном случае также обязательное использование контроля с экстрактом из доброкачественного корма.

Определение токсичности на простейших.

В практике используется несколько вариантов этого способа. В общих чертах этот способ сводится к извлечению токсических компонентов кормов (или другого субстрата) каким-либо растворителем, удалению органического растворителя и переводу остатка в водную среду. В качестве тест-объектовиспользуют чистую культуру простейших, которую выращивают, подкармливая сенным настоем, который содержит клетки бактерий. Для определения токсических свойств экстракта несколько капель его смешивают с культурой простейших. Критерием токсичности служит время гибели простейших от воздействия испытуемого экстракта. При воздействии на простейших резко токсичного экстракта они погибают через 3 -5 минут, токсичного - 8-20 минут, слабо токсичного - через 2 часа. Нетоксичные экстракты позволяют жить простейшим в течение 24 часов и более. Недостатком этого метода является высокая чувствительность простейших к внешним условиям и другим факторам среды обитания.

Определение токсичности на чувствительных микроорганизмах.

Для определения токсичности этим способом необходимо иметь специфические тест-культуры микроорганизмов и системы их культивирования. Недостаток этого способа заключается в том, что каждый токсин требует тестирования своей специфической тест-культурой.

Наиболее часто этот способ используется для тестирования продуктов на микотоксины и антибиотики. Наличие токсического вещества при использовании этого метода определяется по степени задержки роста тест-культуры или образованию зон задержки роста (на плотных питательных средах).

Для реализации тестирования этим способом используют суточные тест-культуры. Несколько капель этой тест-культуры наносят на поверхность агара в чашке Петри и равномерно распределяют по его поверхности (образование газонного роста). Затем растворы исследуемого токсина наносят на бумажные диски или вносят в цилиндрики, расставленные на агаре. Чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста тест-культуры, в течение 24 часов. При наличии в образце токсина вокруг диска (или лунки) образуется зона задержки роста тест-микроба.

Метод серийных разведений также может быть использован для количественного определения токсина (антибиотиков и др.) в испытуемом объекте.

Определение токсичности на рыбах.

Наиболее известен метод определения токсичности зернофуража на рыбах гуппи. Для определения токсических свойств корма его экстрагируют органическим растворителем. Органический экстракт отделяют, фильтруют, а затем упаривают до получения сухого или маслянистого остатка. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона и переносят его в сосуд с 500 мл воды из аквариума, в который и помещают 5 рыб гуппи. Наблюдение ведут в течение 24 часов. В качестве контроля используют 1% раствор ацетона, в котором рыбы гуппи остаются живыми в течение 3 суток.

Определение токсичности на эмбрионах птиц.

Куриные эмбрионы, как биологический тест - объект, получили довольно широкое распространение при изучении токсических свойств афлатоксинов и некоторых других токсических веществ. При введении афлатоксина в желток используют 5 дневные эмбрионы, в воздушную пугу - 1 дневные, в хорионалантоисную - 9 дневные. Экстракт обычно концентрируют и растворяют в пропиленгликоле, который не токсичен для куриных эмбрионов. В желток вводят до 0,5 мл экстракта, в воздушную пугу - до 0,04 мл экстракта. Место введения заклеивается и эмбрионы инкубируют в термостате. Токсичные экстракты задерживают рост и развитие эмбриона на 5-10 сутки. Иногда зародыш погибает. При вскрытии отмечают отёчность, кровоизлияния, дистрофические изменения печени, недоразвитие конечностей и другие аномалии развития эмбриона. При введении экстрактов в хорионалантоисную оболочку зародыш погибает иногда через несколько часов. Однако,наблюдение за эмбрионами ведут в течение 21 суток. Токсическое действие экстрактов определяют также по состоянию эмбриона, изменениях в хорионалантоисной оболочке. Основные патологоанатомические изменения обнаруживаются также в печени, почках и сердце эмбриона.

Определение токсичности на культуре клеток.

Используют первичные и перевиваемые культуры клеток.

Биохимические методы (БХМ).

Группа методик основана на выявлении ядов путём воздействия их на активность некоторых жизненно- важных ферментов. Наиболее часто применяется ферментный метод для определения ядовитых веществ группы ФОС и производных карбаминовой кислоты. Оценивается в % степень угнетения фермента ацетилхолинэстеразы, которая пропорциональна содержанию ядов в патматериале в мг/кг.

Физико-химические методы.

Эта группа методик считается наиболее перспективной, т. к. обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Из физико-химических способов наиболее часто используют хроматографию (бумажную, тонкослойную, газожидкостную, высокоэффективную жидкостную), полярографию, атомно-абсорбционную спектрометрию, нейрон-активационный анализ и другие.

Хроматография - сорбционный, динамический метод разделения смеси веществ. Способ хроматографии впервые разработан русским ученым М. С. Цветом. С помощью процесса хроматографии удается разделить очень сложные смеси веществ. В процессе хроматографии участвует обычно две фазы: неподвижная (адсорбент) и подвижная (элюент). Исследуемый образец с помощью подвижной фазы (элюента) перемещается вдоль адсорбента. Скорость передвижения компонентов исследуемого образца зависит от величин взаимодействия их с адсорбентом и подвижным растворителем (элюент). Различие этих взаимодействий приводит к разности в скоростях движения компонентов через слой адсорбента, в результате чего достигается их разделение.

Хроматографические методы классифицируются по особенностям перемещения зон и по характеру физических явлений, лежащих в основе взаимодействия веществ с сорбентом или иным пористым материалом. При этом рассматривают обычно три типа хроматографических процессов: элюционная хроматография, вытеснительная хроматография и фронтальная хроматография.

Принцип элюционной хроматографии состоит в вымывании веществ из колонки смесью растворителей. Непрерывный процесс сорбции и десорбции веществ, введенных в колонку, приводит в конечном итоге к их разделению.

Вытеснительная хроматография основана на взаимном вытеснении (десорбции) компонентов из колонки. Так, например, было предложено десорбирорать смесь углеводов из колонки, заполненной активированным углем, раствором фенола.

Различные физико-химические процессы взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом определяют деление хроматографических методов на 3 вида.

1. Молекулярную хроматографию, при которой поглощение вещества сорбентом определяется молекулярной адсорбцией. Эта хроматография может осуществляться как с помощью растворов (жидкостная), так и газов (газовая хроматография).

2. Ионобменная хроматография базируется на явлениях ионного обмена между раствором и сорбентом. Сорбентами при этом служат нерастворимые кислоты, основания, ионобменные смолы и другие.

3. Распределительная хроматография - один из растворителей, при этом, находится в порах сорбента, скорость движения веществ по колонке определяется в этом случае коэффициентом распределения разделяемых веществ между неподвижной жидкой фазой (нанесенный на адсорбент) и подвижным растворителем. Этот вид хроматографического разделения веществ используется в бумажной, тонкослойной, жидкостной и газо-жидкостной хроматографиях.

Плоскостная хроматография. В плоскостной хроматографии миграционной средой для различных веществ служит сорбент, имеющий форму листа или пленки.

Хроматография на бумаге. Хроматография на бумаге в токсикологической практике используется довольно редко, так как уступает другим хроматографическим методам в чувствительности и специфичности.

Тонкослойная хроматография. Этот вид хроматографии является распространенным способом полуколичественного определения ядов в кормах, продуктах питания и патологическом материале. В тонкослойной хроматографии используют стеклянные или металлические пластины, которые покрыты тонким слоем неподвижной фазы (адсорбента).

Хроматограмма - графическое или другое представление зависимости сигнала детектора от объема элюента или времени. Этот термин применяют также для обозначения слоя или бумаги после окончания процесса разделения.

Тонкослойная хроматография хроматография, выполняемая в слое адсорбента, нанесенного на подложку (например стеклянную или металлическую пластинку).

· Нисходящая хроматография - растворитель подается на пластинку сверху вниз.

· Горизонтальная хроматография - пластинка расположена в камере строго горизонтально.

· Восходящая хроматография - растворитель поднимается по пластинке снизу вверх под действием капиллярных сил.

· Многократная хроматография последовательное хроматографирование в той же подвижной фазе.

· Ступенчатая хроматография последовательное хроматографирование в различных подвижных фазах.

Газо-жидкостная хроматография.

Различают несколько видов газо-хроматографического исследования. При этом принято использовать ряд специфических терминов, которые приводятся ниже.

Газо-адсорбционная хроматография. Хроматографический метод, в котором неподвижной фазой является твердое тело.

Газо-жидкостная хроматография - (ГЖХ) -Газохроматографический метод, в котором неподвижней фазой является жидкость, нанесенная на твердое тело.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Высокоэффективная жидкостная хроматография - один из наиболее современных видов жидкостной хроматографии на колонках. Чтобы уменьшить влияние диффузии и повысить разрешающую способность колонки, для жидкостной хроматографии применяют

мелкодисперсные сорбенты

ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЯ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ. ПОРЯДОК ВЕДЕНИЯ ДОКУМЕНТАЦИИ И ОФОРМЛЕНИЕ ЗАКЛЮЧЕНИЯ.

Вопросы для самостоятельной подготовки:

1. Химико-токсикологическая лаборатория, цели и задачи.

2. Приборы и оборудование химико-токсикологической лаборатории.

3. Порядок ведения документации и оформление заключения.