Методи кількісного визначення антибіотиків

Для визначення антибіотичної активності використовують хімічні, фізичні та біологічні методи.

Біологічні методи.

Найбільше значення мають біологічні, оскільки лише прямий вплив антибіотиків на мікроорганізми дозволяє виявити антимікробну активність.

Недоліками біологічних методів є тривалість проведення аналізів, залежність точності від багатьох зовнішніх факторів.

Біологічні методи визначення антибіотичної активності можуть мати різне оформлення в залежності від консистенції поживного середовища, на якому здійснюють культивування тест-штамів.

Метод послідовних розведень використовується для визначення кількості антибіотика в культуральній рідині, розчинах чи екстрактах.

Для роботи необхідно підготувати поживний бульйон, придатний для розвитку тест-організму. Необхідною умовою є прозорість поживного середовища. Одночасно готують культуру тест-організму. Стерильний бульйон розливають по пробіркам, в які вносять досліджуваний антибіотик у відповідній концентрації. Після цього усі пробірки засівають культурою тест-організму і через певний час культивування визначають наявність чи відсутність росту тест-організму.

Методом послідовних розведень отримують достовірні результати у разі:

– дотримання умов стерильності проведення дослідів;

– використання постійних середовищ;

– внесення однакової кількості клітин тест-організму.

Іноді під дією досліджуваного антибіотика виникають стійкі до нього форми тест-організму. Поява навіть одиничних резистентних клітин, які можуть в подальшому розвиватися, призводить до помилкових результатів визначення біологічної активності. Для запобігання цьому явищу використовують агаризовані поживні середовища.

Для визначення активності антибіотиків на твердих поживних середовищах найбільш популярний метод – радіальна дифузія антибіотику в агар, який попередньо був засіяний тест-культурою.

Метод є досить простим і добре демонструє випадок антагоністичних взаємовідносин в світі мікроорганізмів. Він заснований на явищі дифузії антибіотику в поживне агаризоване середовище, внаслідок чого створюються несприятливі умови для розвитку відповідної тест-культури.

В основі цього явища лежить закон Фіка, згідно з яким хімічна речовина розповсюджується в гелі з утворенням градієнта концентрації. На процес дифузії антибіотика впливає значна кількість різноманітних факторів: сама тест-культура, утворення продуктів метаболізму, які теж дифундують в агар та інше. Тому вважаємо, що це явище засновано на законі Фіка з певним припущенням.

Для отримання достовірних результатів цим методом необхідно дотримуватися наступних вимог щодо його виконання:

1) стандартність поживного середовища за складом.

Якщо використовують поживні середовища на базі панкреатичних гідролізатів казеїну, дріжджових та м’ясних екстрактів, пептонів в певних пропорціях, то такі поживні середовища дуже складно стандартизувати.

2) однаковий фізіологічний стан та кількість тест-культури.

Метод з використанням металевих циліндрів. Активність антибіотиків визначають шляхом порівняння ступеню пригнічення росту чутливих мікроорганізмів в результаті дії випробовуваного антибіотика і стандартного зразка у відомих концентраціях. Робочими стандартами при дослідженні антибіотику служать спеціальні чисті зразки препаратів, активність яких встановлюється за міжнародними стандартними препаратами. Робочі стандарти випускають і зберігають в запаяних ампулах з нейтрального скла і зберігають при температурі не вищій за 0ºС.

В чашку Петрі заливають середовище певного складу в один або два шари. Для нижнього шару використовують незасіяні середовища, для верхнього – агаризоване середовище попередньо засівають відповідною тест-культурою. Наприклад, для визначення активності бензилпеніциліну калієвої та натрієвої солі, оксациліну і взагалі усіх інших похідних пеніцилінових антибіотиків – тест-мікроорганізм Staphylococcus aureus штам 209, для хлортетрацикліну – Bacillus subtilis var. L2, для ерітроміцину – тест-культура Bacillus mycoides НВ₂ гладка форма, для граміцидину – Bacillus mycoides 537 складчата форма.

Тест-культури повинні бути внесені у певній кількості – засівній дозі, яка виражається кількістю клітин на 1 мл середовища.

Середовище повинне бути певного складу. Часто буває так, що для верхнього і нижнього шару у чашці Петрі склад середовища різний. Якщо культура – це суспензія вегетативних клітин, то температура середовища не повинна перевищувати 48-50ºС. При використанні суспензії спор – 65-70ºС.

Після того як агар ущільниться, на його поверхню за допомогою трафарету під кутом 60º встановлюють 6 стерильних циліндрів із нержавіючої сталі або алюмінію (циліндри також стандартні – однакова маса, розмір - 10 мм заввишки і внутрішній діаметр 6 мм). В циліндри кожної чашки вносять по 0,1 мл стандартного розчину і розчину, що досліджується на антибіотичну активність. Після цього чашки закривають і протягом 2 год витримують при кімнатній температурі. За цей час відбувається дифузія антибіотику в агар (рис. 2.4).

 

Рис. 2.4. Визначення активності антибіотиків на твердих поживних середовищах з використанням металевих циліндрів (Егоров, 2004).

 

Чашки встановлюють на інкубацію (температура 36-38ºС протягом 18 год). Після цього діаметри зон пригнічення росту, які утворились у випадку стандартного і досліджуваного препарату, вимірюють як можна точніше. При вимірюванні доцільно використовувати мікроскоп з відеокамерою і комп’ютером. Потім за допомогою деяких програм роблять необхідні підрахунки.

Такий метод досить затратний за тривалістю та потребує статистичної обробки, тому ведеться пошук альтернативних методів визначення антибіотичної активності, більш оперативних та точних.

Метод з використанням лунок в агарі. В агаровій пластинці роблять лунки діаметром 8 мм, використовуючи пробкове свердло. Блоки, надрізані свердлом на всю товщину агарової пластинки, видаляють за допомогою стерильного скальпеля чи спеціального крючка. В одні лунки вносять розчин досліджуваного антибіотика, в інші – стандартні розчини антибіотика.

Перевагою цього методу є відсутність необхідності стерилізації металевих циліндрів.

Метод з використанням дисків фільтрувального паперу. На поверхню поживного середовища засіяного тест-культурою розкладають диски фільтрувального паперу змочені досліджуваним розчином антибіотика та його стандартними розчинами. Промисловістю випускаються готові диски з антибіотиками.

Турбідиметричні методи.

У певне поживне середовище вносять суспензію вибраних мікроорганізмів, чутливість яких до випробуваного антибіотика така, що забезпечує достатньо сильне пригнічення їх росту за умов проведення випробування. Використовують певну кількість суспензії, яка підбирається таким чином, щоб одержати легко вимірювану каламутність після закінчення інкубаційного періоду тривалістю близько 4 год.

Готують також розчини стандартного зразка з відомими концентраціями і розчини випробуваного антибіотика, передбачувані концентрації яких не мають істотних відмінностей від відповідних концентрацій стандартного зразка. Рівні об’єми кожного з розчинів вносять в однакові пробірки і додають у кожну пробірку рівні об’єми інокульованого середовища (наприклад, 1 мл розчину і 9 мл середовища).

У той самий час готують дві контрольні пробірки з інокульованим середовищем, що не містить антибіотика, в одну з яких негайно вносять 0,5 мл формальдегіду. Ці пробірки використовують для настроювання оптичного приладу, за допомогою якого здійснюють вимірювання.

Пробірки встановлюють на інкубацію при необхідній температурі від 3 до 4 годин. Після закінчення періоду інкубації зупиняють ріст мікроорганізмів, додаючи в кожну з пробірок 0,5 мл формальдегіду, або шляхом теплової обробки, і за допомогою оптичного приладу вимірюють каламутність вмісту пробірок з точністю до третього знаку. Розраховують активність з використанням відповідних статистичних методів.

Методи, що базуються на реєстрації відповідних продуктів метаболізму тест-організму.

Метод заснований на вимірюванні концентрації іонів металів або метаболітів, що виходять з клітини при порушенні цитоплазматичної мембрани чутливих до антибіотиків тест-культур, бо ще одним з механізмів дії антибіотику на мікробну клітину є порушення проникності цитоплазматичної мембрани. Внаслідок цього порушення клітина втрачає життєво важливі компоненти – іони калію, магнію, АТФ.

Виявлення цих компонентів в середовищі проводять за допомогою фізико-хімічних методів, таких як полум’яна фотометрія, атомно-абсорбційна спектроскопія, радіометрія, використання іоно-селективних електродів. Наприклад, антибіотик ністатин визначають за допомогою тест-культури Saccharomyces cerevisiae, вимірюючи вміст іонів калію методом полум’яної фотометрії. Ністатин можна також визначити за реєстрацією іонів магнію і рубідію. Їх визначають за допомогою атомно-абсорбційної спектрометрії.

Граміцидин – тест-культура Streptococcus faecalis, реєструють кількість іонів рубідію за допомогою полум’яної фотометрії.

Гентаміцин – тест-культура E. colі, визначають кількість АТФ за допомогою методу біолюмінесценції.

Методи, які базуються на виділенні тепла або СО₂ в довкілля.

Кількість виділеного тепла або СО₂ залежить від росту мікроорганізму і від інтенсивності процесів метаболізму. Запропонований метод фіксує зміну життєдіяльності мікроорганізму під впливом антибіотику. СО₂ реєструють за допомогою чутливого електроду. Щодо реєстрації виділеного тепла, то зміна тепловіддачі фіксується методом калориметрії. Тому, кількість виділеного культурою в одиницю часу тепла, СО₂ або будь-яких специфічних ферментів може бути основою для кількісної оцінки активності антибіотика.

а) визначення активності по виділенню СО₂: визначають за допомогою СО₂-чутливого електроду або радіометричним методом. Наприклад, пригнічення утворення СО₂ у суспензії клітин E. coli пропорційно концентрації тетрацикліну хлориду в інтервалі 33 – 167 мкг/мл. Перевага: висока швидкість (4 хв.), простота та дешевизна;

б) визначення антибіотичної активності по виділенню тепла: навіть невеликі зміни метаболізму пов’язані із зміною швидкості виділення тепла, що реєструються калориметричними методами.

Вплив антибіотика на біолюмінесценцію.

Базується на тому, що енергетичне забезпечення біолюмінесценції здійснюється через загальні метаболічні шляхи клітини. У відповідності з цим, інтенсивність біолюмінесценції знаходиться у прямій залежності як від вмісту метаболітів, що є у клітині, так і від додавання сторонніх для клітини речовин, які активно включаються у внутрішні ферментативні процеси. Так, наприклад, з допомогою фотобактерій визначається активність ХТЦ та граміцидину С. Визначення антибіотичної активності ХТЦ базується на вимірюванні швидкості ферментативного процесу дії ферменту люциферази, тобто на вимірюванні інтенсивності світіння, чи біолюмінесценції, після контакту з антибіотиком.

Хімічні та фізико-хімічні методи визначення антибіотиків

Хімічні та фізико-хімічні методи визначення антибіотичної активності все ширше використовуються в практиці. Їх перевага в порівнянні з біологічними методами полягає в швидкому проведенні аналізів. В ряді випадків хімічні та фізико-хімічні методи поступаються біологічним методам за точністю, однак їх висока швидкість сприяє розвитку саме цього напряму визначення антибіотичної активності.

Хімічні методи визначення кількості антибіотиків застосовуються досить рідко. Відомі кілька модифікацій визначення пеніцилінів, в основу яких покладене поглинання йоду продуктами гідролізу пеніцилінів. Використовують також ацидометричний спосіб. При розщепленні молекули пеніциліну за допомогою ферменту пеніцилінази або лугу з утворенням пеніциланової кислоти відбувається звільнення однієї карбоксильної групи, яку можна врахувати методом хімічного титрування.

Досить часто застосовують колориметричні та спектрофотометричні методи визначення концентрації антибіотиків. В основу колориметричних методів покладений принцип перетворення препарату або його окремих угрупувань в забарвлені сполуки. Спектрофотометричні методи засновані на властивостях багатьох антибіотиків давати характерний спектр поглинання у видимій або ультрафіолетовій ділянці спектру.

 

Питання для самоконтролю:

1. В яких одиницях виражається активність антибіотиків?

2. Дайте визначення «одиниці антибіотичної активності».

3. Що таке антибіотична продуктивність мікроорганізмів?

4. Які методи використовують для визначення антагоністичної активності мікроорганізмів?

5. На яких принципах базуються біологічні методи кількісного визначення антибіотиків?

6. Опишіть методи визначення протипухлинної дії антибіотиків.

7. Які методи дозволяють реєструвати противірусну дію антибіотиків?

8. Які умови дозволяють отримати найбільш точні результати у разі визначення активності антибіотиків біологічними методами?

9. Охарактеризуйте методи визначення антибіотиків на твердих поживних середовищах.

10. Вимоги до тест-культур, що використовуються для визначення кількості антибіотиків.

11. Який Вам відомий хімічний метод визначення активності антибіотиків? Принцип цього методу.

12. Наведіть приклади фізико-хімічних методів визначення антибіотиків.