Тема 1. Методы исследования .

Тема 1. Методы исследования.

Какова цель изготовления тонких срезов тканей и органов? С какой целью окрашивают срезы тканей и органов для световой микроскопии? Понятие о базофилии и ацидофилии. Окрашивание гематоксилин-эозином (суть метода, результат окрашивания).

· Цель - уменьшение толщины материала для того, чтобы он просвечивался в световом микроскопе.

· С какой целью окрашивают срезы - различие отдельных структур тканей и клеток, т.к. без окрашивания клеточные структуры бесцветны и прозрачны.

· БАЗОФИЛИЯ - способность кислых структур клетки окрашиваться основными красителями (гематоксилин, толуидиновый синий, метиленовый синий).

· АЦИДОФИЛИЯ- способность основных структур клетки окрашиваться кислыми красителями (эозин, оранж G, кислый фуксин).

· Суть:

1) Парафиновые срезы освобождают от парафина

2) Производят гидратацию срезов путём поэтапного помещения их в спирты убывающей концентрации, а затем в дистиллированную воду На 3-4 мин.

3) Окрашивают срезы сначала раствором ядерного (основного) красителя - гематоксилина – В течение 2 мин.

4) После этого срезы переносят в водопроводную воду, которая имеет щелочную среду, для окисления гематоксилина. При этом он приобретает синий цвет, а затем всполаскивают в дистиллированной воде.

5) Окрашивают срезы раствором цитоплазменного (кислого) красителя - Эозина – в течение 0,5-1 мин.

6) Избыток красителя смывают дистиллированной водой в течение 1 мин.

7) Окрашенные срезы обезвоживают. Для этого их помещают в Спирты возрастающей концентрации.

8) Обезвоженные срезы просветляют в карбол-ксилоле, а затем в двух порциях ксилола – по 2 мин.

9) Заключение срезов.

· Сочетает в себе основной и кислый красители, поэтому позволяет выявить почти все структуры. Ядра - сине-фиолет, Цитоплазма—желто-розов.

 

4. Назовите виды микроскопии, с помощью которых можно исследовать живые клетки и культуры тканей. Опишите суть данных методов и механизм возникновения изображений.

· Темнопольный микроскоп применяется для получения изображений прозрачных живых объектов. Используется эффект Тиндаля (который позволяет видеть пылинки в луче света в темной комнате). Под конденсором установлена заглушка таким образом, чтобы свет попадал только на края конденсорной линзы. Поэтому свет, выходящий из конденсора, не попадает в объектив: при отсутствии образца видно только темное поле. При наличии препарата свет, проходя через него, отклоняется и попадает в объектив: объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом).

· Фазово-контрастный микроскоп применяется для исследования изображений прозрачных (неокрашенных) объектов, особенно живых клеток в культуре. Препарат должен быть тонким. В основе метода лежит следующее явление: скорость света зависит от среды, через которую он проходит. При переходе из воздуха в более плотную среду электромагнитная волна замедляется. Поскольку разные участки препарата имеют разные показатели преломления, то лучи, прошедшие через оптически более плотные участки, будут отставать от лучей, прошедших через оптически менее плотные участки – возникает фазовый сдвиг между лучами. Величина сдвига зависит от показателей преломления сред и длины пути, пройденного в каждой среде. Однако фазовый сдвиг не улавливается глазом человека. Поэтому специальные устройства (заглушка; фазовая пластинка в объективе) преобразуют фазовый сдвиг в различия в интенсивности (яркости) света, которые воспринимаются глазом.

· Интерференционная микроскопия – это дальнейшее развитие фазово-контрастной и поляризационной микроскопии. Этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Суть метода состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой — мимо неё. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей (луч, проходящий через объект, запаздывает по фазе). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. В методе дифференциального интерференционного контраста (ДИК) обе волны проходят через один и тот же объект с небольшим боковым смещением. Наибольшее распространение получил вариант ДИК по Номарскому, в котором разделение и сведение пучков производятся в поляризованном свете с помощью специальных двоякопреломляющих призм, установленных соответственно перед конденсором и после объектива. Величина разведения пучков выбирается близкой к разрешающей способности микроскопа, чтобы не было заметно двоение изображения. Получаемое цветное изображение рельефно.

Дополнительно было.

1.Перечислить предсказуемые артефакты зависящие от образца ткани для исследования.

Это структура, наблюдаемая в тканях под микроскопом, тогда как в живой клетке она отсутсвует. Сдавление, разрыв ткани, деформация, фрагментация, аутолиз тканей, формалиновый пигмент, неравномерная фиксация, ошибка при проводке, недостаточная проводка, плохая деперефикация.

2. Что такое криофракционирование? Каковы преимущества по сравнению с традиционными методами изготовления препаратов для ЭМ?

Современный метод, суть которого заключается в изучении структуры объектов, замороженных при температуре жидкого N. Быстрозамороженный тонкий слой образца помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160. Метод позволяет изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией

Тема 1. Методы исследования.