Высаливание белков. Высаливающие агенты. Механизм высаливания. Практическое использование высаливания.

Высаливание белков. Высаливающие агенты. Механизм высаливания. Практическое использование высаливания.

Высаливание- осаждение белков солями ЩМ и ЩЗМ (Na2SO4, (NH4)2SO4)

Растворимость белков зависит от концентрации солей(ионной силы). В дистиллированной воде белки растворяются плохо, однако растворимость возрастает при повышении ионной силы. При повышении ионной силы белки лишаются гидратной оболочки, что приводит к агрегации и выпадении белков в осадок

Механизм высаливания: ионы солей притягивают к себе молекулы воды, уменьшая тем самым количество воды, взаимодействующей с белком, т.к. при высокой концентрации солей количество ионов солей огромно по сравнению с заряженными группами белков. А т.к. растворимость белка в воде зависит от образования гидратной оболочки вокруг гидрофильных ионогенных групп, то перемещение молекул воды к ионам солей снижает растворимость белка и он выпадает в осадок.

Применяя растворы солей различной концентрации, можно последовательно осаждать белки по фракциям. Так, при малой концентрации солей осаждаются наиболее крупные, тяжелые и обладающие наименьшим зарядом частицы. При повышении концентрации солей выпадают все более мелкие и устойчивые белковые фракции.

Методом высаливания осаждают белки сыворотки крови. Из водных растворов белки можно осадить и с помощью водоотнимающих растворов (метиловый, этиловый спирты, ацетон). По своей природе и механизму процесс высаливания существенно отличается от коагуляции электролита.

Денатурация белков. Факторы, механизм, практическое использование денатурации белков.

Денатурация- нарушение пространственной структуры белка, сопровождающееся потерей его нативных свойств: растворимости, биологической активности, электрофоретической подвижности.

Изменение температуры, ионной силы, рН, а также обработка органическими и дистабилизирующими агентами могут привести к нарушению нативнойконформации. Агенты образуют связи с карбоксильными аминогруппами и некоторыми боковыми радикалами АК, подменяя совбственными связями внутримолекулярные взаимодействия в белке, из-за чего 2-ая и 3-ая структуры меняются. Изменения не касаются 1-ой структуры, но био. активность белка утрачивается.

Агенты: 1) высокая температура – разрушение слабых связей(водородных и ионных гидрофильных

Кислоты и щелочи- изменение ионизации ионногенных групп в радикалах АК; разрушение ионных и водородных связей

3) мочевина- разрушение внутриклеточных водородных связей в результате образования водородных связей с мочевиной

4) соли тяжелых Ме (Hg, Pb) - образование прочных связей и формирование нерастворимых комплексов

Органические растворители (этиловый спирт, ацетон)

6) Механическое воздействие (например, вибрация).

Применение: 1) очистка растворов от белковых примесей

Стерилизация мед. Инструментов и материалов в автоклавах

 3) денатур. агенты- антисептики(фенол, хлорамин)

Лечение гнойных ран(фенол- компонент мази Вишневского)

Электрические свойства белков. Механизм возникновения электрического заряда белков. Изоэлектрическая точка. Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови на бумаге, протеинограмма здорового человека.

Электрические свойства белков определяются присутствием на их поверхности положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Наличие заряженных группировок белка определяет суммарный заряд белковой молекулы. Если в белках преобладают отрицательно заряженные аминокислоты, то его молекула в нейтральном растворе будет иметь отрицательный заряд, если преобладают положительно заряженные – молекула будет иметь положительный заряд. Суммарный заряд белковой молекулы зависит и от кислотности (рН) среды. При увеличении концентрации ионов водорода (увеличении кислотности) происходит подавление диссоциации карбоксильных групп и в то же время увеличивается число протонированныхамино-групп

Таким образом, при увеличении кислотности среды происходит уменьшение на поверхности молекулы белка числа отрицательно заряженных и увеличение числа положительно заряженных групп. Совсем другая картина наблюдается при снижении концентрации ионов водорода и увеличении концентрации гидроксид-ионов. Число диссоциированныхкарбоксильных групп возрастает и снижается число протонированных аминогрупп

Итак, изменяя кислотность среды, можно изменить и заряд молекулы белка. При увеличении кислотности среды в молекуле белка снижается число отрицательно заряженных группировок и увеличивается число положительно заряженных, молекула постепенно теряет отрицательный и приобретает положительный заряд. При снижении кислотности раствора наблюдается противоположная картина. Очевидно, что при определенных значениях рН молекула будет электронейтральной, т.е. число положительно заряженных групп будет равно числу отрицательно заряженных групп, и суммарный заряд молекулы будет равен нулю

ИЭТ(pl)- значение рН, при котором суммарный заряд белка=0 и белки не перемещаются в электрическом поле. Зная АК состав белка, можно приближенно определить ИЭТ. Она является характерной константой белков. ИЭТ большинсва белков животнх тканей лежитт в пределах от 5,5 до 7,0, что говорит частичном преобладании кислых АК. Однако в природе имеются белки, у которых значения ИЭТ лежат в крайних значениях рН среды.

 В ИЭТ белки наименее устойчивы в растворе и легко выпадают в осадок. ИЭТ белка в сильной степени зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину не влияет концентрация белка.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки крови на бумаге: Метод основан на различии величины заряда белков сыворотки крови. Если нанести каплю сыворотки на полоску хроматографической бумаги, смоченной буферным раствором, и пропустить через эту полоску постоянный электрический ток, отдельные белки будут продвигаться в электрическом поле с различной скоростью. При рН=8,6 белки сыворотки крови движутся по направлению к аноду, поскольку они обладают в этих условиях отрицательным зарядом. Наиболее быстро движутся альбумины, затем а1- и а2-глобулины, далее в - глобулины и наконец q - глобулины.

АППАРАТУРА: Прибор для определения белков в крови методом электрофореза на бумаге состоит из выпрямителя, электрофоретической кюветы и денситометра.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Кюветы заполняются вероналовым буфером рН = 8,6. Нарезают из хроматографической бумаги полоски длиной 38 см., шириной 3 см., полоски смачивают буферным раствором и помещают в кювету. Ближе к отрицательному полюсу наносится сыворотка (0,01 мл), затем прибор включается в электрическую сеть.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки на бумаге производится обычно в течение 6- 24 часов при напряжении 150 Вт и силе тока 6-8 А. По истечении указанного срока бумажные полоски сушат в сушильном шкафу при температуре около 100 градусов в течение 5 мин., затем красят бромфеноловым синим. Остатки красителя, не связавшегося с белками, отмывают с полоски бумаги 10% уксусной кислотой.

12. Количественные методы определения белка. Принцип определения содержания белка крови биуретовым методом. Нормальное содержание белка крови. Гипо-, гиперпротеинемия. Белковый коэффициент крови.

Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

•     спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

•     рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

•     нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

•     поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

 Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота)

Биуретовый метод — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе

Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют при 540—560 нм.

Рисунок 3 – Калибровочный график

+Измеряют оптическую плотность исследуемого раствора наносят ее значение на ось ординат, и, используя калибровочный график, на оси абсцисс находят соответствующее значение концентрации анализируемого вещества