История развития представлений

ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ

ОБ АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВАХ

И ХИМИОПРЕПАРАТАХ

 

Задачи курса и его содержание. Основная задача данного курса - это ознакомление студентов с технологией ферментных препаратов микробного происхождения. Технологией ферментных препаратов может быть названа совокупность технологических приемов, осуществление которых на соответствующем оборудовании при наличии необходимых исходных материалов обеспечивает получение ферментных препаратов заданных свойств.

Во вводной части курса кратко изложены история возникновения и перспективы развития отрасли, основы номенклатуры выпускаемых в России ферментных препаратов, сведения об основных источниках получения ферментов, о методах определения активности, об условных единицах активности, с помощью которых выражается производительность предприятий.

В первой части детально описываются основные технологические приемы, используемые при поверхностном и глубинном культивировании продуцентов, а также при получении очищенных ферментных препаратов из культур микроорганизмов и животного сырья.

Часть вторая посвящена описанию некоторых особенностей получения препаратов, обладающих определенной активностью, например амилазной, протеазной, целлюлазной и т. д. Попутно в самом общем виде излагается механизм действия ферментов на субстрат, что в известной степени позволяет прогнозировать состав питательной среды и условия культивирования, а также свойства готовых ферментных препаратов и возможные направления их использования.

 

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ФЕРМЕНТОВ

 

 

ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ПРОИЗВОДСТВЕ

В своей практической деятельности человек использует ферментативную активность микроорганизмов очень давно. Культуры грибов уже несколько тысяч лет назад в Китае, Корее, Японии и некоторых других странах применяли для осахаривания крахмалистых продуктов и для получения спирта.

Винокурение, хлебопечение, обработка волокнистых растений, получение кисломолочных продувов известны человечеству с давних времен. Однако использование не ферментной активности микроорганизмов, а собственно ферментов как индивидуальных химических соединений специфического и сложного строения началось сравнительно недавно. Ферменты в промышленных масштабах производятся в ССС, Японии, США, Англии, Франции, Голландии, Дании, Швейцарии, Чехословакии, Венгрии, Польше и ряде других стран.

Основными поставщиками ферментов из микроорганизмов до последнего времени были грибы. Однако сейчас все более широкое применение находят ферменты и некоторых бактерий (табл. 18.1).

Согласно принятой системе классификации все ферменты подразделяют на шесть классов. 1. Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3. Гидролазы. 4. Лиазы. 5. Изомеразы. 6. Лигазы (синтетазы).

Наиболее широкое применение получили ферменты микроорганизмов, относящиеся в гидролазам (гликозидазы, пептидазы и др.). Они воздействуют на глюкозидные, пептидные, эфирные и некоторые другие связи с участием воды:

 

XY+HOH→XH+YOH

 

Среди гидролаз много внеклеточных ферментов. Выделяясь из клеток, они накапливаются в культуральной среде. Получение таких ферментов, как уже отмечалось, проще и дешевле, чем выделение из клеток. Поэтому гидролазы представляют особый интерес и наиболее часто используются.

 

Гликозидазы

 

К гликозидазам относится большое число микробных ферментов, катализирующих гидролиз гликозидных соединений. Изучаются и применяются они давно. В эту группу входят амилолитические ферменты, гидролизующие крахмал: α- и β-амилазы и глюкоамилаза. Эти гидролазы в зависимости от происхождения (животные, растения, грибы, бактерии) различаются по строению, молекулярным массам, термостабильности, оптимуму рН и другим свойствам. Многие микроорганизмы образуют α-амилазу (1,4-α-D-глюканглюканогидролазу), гидролизующую внутренние α-1,4-глюкозидные связи в амилазе и амилопектине с образованием мальтозы, декстранов и небольшого количества глюкозы. Синтез β-амилазы у микроорганизмов наблюдается реже.

Продуцентами α-амилазы, применяемыми в практических целях, являются Bacillus licheniformis, Вас. amyloliquefaciens, Aspergiellus oryzae и некоторые другие микроорганизмы. Интересен тот факт, что α-амилаза Вас. licheniformis обладает очень высокой термоустойчивостью и способна гидролизовать крахмал при температуре около 100°С.

Широко представлена, в основном у грибов, глюкоамилаза (1,4- α-D-глюкан-глюканогидролаза). У Asp. niger она состоит из двух глюкопротеинов с молекулярной массой около 100000 дальтон.

Декстраназа (1,6- α-D-глюкан-глюканогидролаза) воздействует на 1,6-глюкозидные связи в декстране. В большом количестве ее образуют Penicillium purpurogenium и некоторые другие грибы этого рода.

Фермент пуллуланаза (пуллулан-6-глюканогидролаза) гидролизует грибной полисахарид пуллулан, а также гликоген, аминопектин и декстрины, последние образуются из амилопектина и гликогена. Интересно, что фермент пуллуланаза получают из грамотрицательной бактерии Klebsiella pneumoniae, редко используемой в качестве продуцента ферментов.

Лактаза или β-галактозидаза (β -D-галактозид-галактогидролаза) превращает лактазу в глюкозу и галактозу. Продуцируют фермент Е. coli, Asp. niger, Saccharomyces cerevisiae, Curvularia inaqualis, Alternaria tenuis и некоторые другие микроорганизмы.

Инвертаза (β-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза) расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу. Образуют ее многие представители рода Aspergillus (Asp. awamori, Asp. batatae, Asp. niger), дрожжи, а также отдельные штаммы Bacillus subtilis и Вас. diastaticus.

Целлюлолитические ферменты (целлюлазы) - сложный комплекс активных белков, действующих на различные участки молекул целлюлозы. С₁-компонент (экзонуклеаза) действует на нативную целлюлозу (хлопок, фильтровальная бумага); С_x-компонент (эндонуклеаза) гидролизует клетчатку, переведенную в растворимую форму (карбоксиметилцеллюлозу). Вместе с целлюлазами микроорганизмы продуцируют целлобиазу (β-глюкозидаза), гидролизующую целлобиозу, и гемицеллюлазу, действующую на гемицеллюлозу. В конечном счете гидролиз целлюлозы приводит к образованию глюкозы.

Выпускаемые промышленностью препараты целлюлолитических ферментов обычно обладают активностью С, и С_x, а также целлобиазной и гемицеллюлазной активностями; эти препараты стабильны в широком диапазоне рН (от 3,0 до 8,0). Продуцентами целлюлаз являются многие мицелиальные грибы, в том числе Penicillium notatum, P. va riabile, P. iriense, Trichoderma roseum, Verticillium alboatrum и др. Продуцируют целлюлазы и некоторые бактерии, но их свойства изучены мало.

Значительное число микроорганизмов образуют ферменты, разлагающие пектины. Пектины (полигалактурониды) состоят из остатков D-галактуроновых кислот, соединенных α-1,4-глюкозидными связями. Карбоксильные группы галактуроновой кислоты могут быть полностью или частично этерифицированы метанолом.

Пектолитические ферменты образуют комплексы, отдельные компоненты которых расщепляют молекулу пектина в различных местах. Пектиназы (полигалактуроназы) широко распространены у микроорганизмов (грибов и бактерий); у растений они встречаются редко.

Известны ферменты, осуществляющие негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между С₄ и C₅. Грибные пектолитические ферменты имеют оптимум рН от 3,5 до 5,0; они более стабильны. Некоторые фитопатогенные грибы обладают высокоактивным пектолитическим комплексом ферментов (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum forma lycopersici), обусловливающим их патогенность. Фитопатогенные виды Erwinia вызывают распад тканей ряда растений благодаря высокой активности пектинолитических ферментов.

Анаэробная бактерия Clostridium felsineum продуцирует пектатрансэлиминазу, полигалактуроназу и пектинэстеразу. Четыре пектинолитических фермента обнаружены у факультативного анаэроба Bacillus polymyxa. Они характеризуются различными значениями оптимума рН и дают различные продукты гидролиза.

 

Протеиназы

 

Протеиназы, или протеазы (пептид-пептид-гидролазы), катализируют разрыв пептидных связей белков с образованием свободных аминокислот, ди- и полипептидов. Таких ферментов очень много. Некоторые из них получены в кристаллическом состоянии. По своим свойствам протеиназы микрорганизмов могут существенно различаться. Они бывают нейтральными (у Вас. subtilis, Asp. terricola), кислыми (Asp. foetidus) и щелочными, т. е. активными при различных значениях рН.

Некоторые микроорганизмы обладают несколькими протеиназами. Так, Actinomyces fradiae синтезирует шесть протеиназ. Полученный при использовании этого микроорганизма ферментный препарат «протофрадин» содержит лейцинамино- и карбоксипептидазы, сериновые протеиназы с трипсиновой, химотрипсиновой и эластазной активностями. Из культуральной среды Act. r im osus выделен комплекс протеиназ, названный «римопротелином», а из Streptomyces griseus - «протелин», гидролизующий казеин, эластин, обладающий трипсиновой, химотрипсиновой активностями и сходный с проназой.

Из Asp. terricola получен активный препарат протеиназы, лизирующий тромбы крови без гемолиза эритроцитов.

Одним из протеолитических ферментов, получаемых в промышленных количествах, является коллагеназа Clostridium histolyticum. Субстратом коллагеназы служат коллаген-белковая основа коллагеновых волокон соединительной ткани (сухожилия, сетчатый слой кожи, хрящи, связки). Пепсин, химотрипсин, трипсин, проназа отщепляют концевые пептидные группы коллагена, но не действуют на нативный коллаген.

Коллагеназа Cl. histol i t y cum действует на коллагены различного происхождения (шкуры животных, плавательные пузыри рыб и др.) с образованием различных продуктов, преимущественно пептидов с молекулярной массой около 500. Два трипептида доминируют в продуктах гидролиза: глицил-пролил-аланин и глицил-гистидин-пролин. Ряд грибов и Вас. subtilis образуют протеиназы, похожие на ренин животных.

Аспартаза (L-аспартат-NH₃-лиаза) осуществляет разложение аспарагиновой кислоты и активно проводит ее синтез из фумаровой кислоты и аммиака. Продуцируют этот фермент Е. coli и ряд других бактерий.

Практический интерес представляют декарбоксилазы аминокислот, образуемые рядом бактерий, в частности фермент, действующий на лизин (L-лизин-карбоксилиаза).

 

Липазы и другие гидролазы

 

Из ферментов, участвующих в липидном обмене, наибольший практический интерес представляют липазы (триацилглицерол-ацилгидролазы). Продуцентами липаз, выделяемых в культуральную среду, служат многие грибы из числа Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Geotrichum, некоторые дрожжи (Candida) и бактерии (Pseudomonas). Липазы катализируют гидролиз триацилглицеролов с образованием жирных кислот и глицерина.

Фосфокиназы расщепляют сложноэфирные связи между жирными кислотами, глицерином и фосфатидиловой кислотой. Они также имеют широкое распространение у микроорганизмов, особенно часто встречаются у спорообразующих бактерий рода Clostridium и Bacillus.

Пенициллинацилазы (пенициллин аминогидролазы, иначе называемые пенициллинамидазами) катализируют гидролиз пенициллина. Это имеет большое практическое значение для получения полусинтетических пенициллинов, а также инактивации антибиотика. Продуцентами ферментов являются Е. coli и некоторые другие бактерии, а также гриб Neurospora crassa. С помощью ацилаз L-аминокислот возможно разделение их на L- и D-формы, поскольку этот фермент гидролизует только ацил-L-изомер. В результате отщепления от него ацильной группы образуется L-аминокислота, которая более растворима. Продуцентами аминоациллазы, имеющими практическое значение, являются некоторые мицелиальные грибы и дрожжи. Аспарагиназа, образуемая в значительном количестве некоторыми штаммами Е. coli и Erwinia carotinovora, отщепляет амидную группу от аспартата, что также имеет практическое значение.

 

Литические ферменты

 

Такие ферменты способны вызывать лизис вещества клеточной стенки у многих видов бактерий и дрожжей. По действию литические ферменты микробного происхождения сходны с лизоцимом, но отличаются от него тем, что это комплекс, в состав которого могут входить α- и β-маннозидазы, глюконазы, протеиназы, амидазы, липазы, хитиназы и другие ферменты. Последовательность действия отдельных компонентов такого сложного комплекса по отношению к различным клеткам и в зависимости от продуцента различна. Протеиназы обычно действуют раньше глюконаз на клетки дрожжей, но известно, что β-1,3- и β-1,6-глюконазы Вас. subtilis лизируют дрожжевые клетки без участия протеиназ. Продуцируют литические ферменты также некоторые актиномицеты (Actinomyces griseus, Thermoactinomyces vulgaris) и бактерии из рода Pseudomonas.

 

Негидролитические ферменты

 

К негидролитическим ферментам относятся отдельные оксидоредуктазы, лиазы, изомеразы, а также лигазы. Негидролитические ферменты используются в практике пока сравнительно редко.

Лактатлиазы и пектинлиазы, как уже отмечалось выше, вместе с другими ферментами осуществляют разложение пектиновых веществ. Продуцируют их бактерии родов Erwinia, Bacillus, Clostridium, а также представители некоторых грибов рода Aspergillus.

Фумарат-гидратаза, или фумараза (L-малат-гидро-лиаза), образуемая многими микроорганизмами, катализирует образование малата из фумарата и H₂O. К числу бактерий, активно осуществляющих такую реакцию, относится Е. coli.

Изомеразы превращают глюкозу во фруктозу и ксилозу в ксилулозу. Продуцентами глюкозоизомеразы являются некоторые бактерии (Streptomyces и Bacillus), а также грибы из рода М u со r. Фермент используется для получения смеси D-глюкозы и фруктозы как заменителя сахарозы при гидролизе крахмала до глюкозы.

Глюкозооксидаза (β-D-глюкозо:O₂-оксидоредуктаза) осуществляет реакцию окисления β-D-глюкозы молекулярным кислородом с образованием D-глюконо-σ-лактона и пероксида водорода. Продуцируют фермент Penicillium vitale, P. notatim и Asp. ni ger.

Каталаза катализирует реакцию

2 Н₂О₂ + 2 Н₂O + О₂

Фермент образуют в большом количестве грибы рода Aspergillus и Penicillium (Р. vitale), а также некоторые дрожжи и бактерии. Помимо получаемых в производственных условиях и в промышленном масштабе, имеется ряд ферментов, пока используемых в ограниченном количестве, но некоторые из них чрезвычайно важны. К их числу относятся так называемые рестриктазы (эндонуклеазы), осуществляющие расщепление нуклеиновых кислот, и лигазы, участвующие в их синтезе. И те и другие необходимы для работ в области генетической инженерии. Продуцентами таких ферментов служат различные микроорганизмы.

 

Диализ

Диализ - это первый изученный и промышленно развитый мембранный процесс, поскольку для его осуществления не нужна сложная аппаратура и специальные мембраны. Сущность диализа в том, что если два раствора с различной концентрацией какого-либо компонента разделить мембраной, то начнется естественный процесс диффузии, достигающий равновесия при выравнивании концентраций этого компонента с обеих сторон мембраны. Интенсивность переноса вещества Q _В через мембрану определяется коэффициентом диффузии этого вещества в материале мембраны D_B, и пропорциональна разности концентраций ΔС. Эту зависимость можно записать в виде сравнения: Q _В = D_B • S • ΔС, где S - площадь мембраны.

Соответственно, чем больше различие в величинах коэффициентов диффузии двух компонентов, находящихся в растворе, тем лучше они разделяются мембраной. Понятно, что белковые молекулы (высокомолекулярные вещества) и органические и неорганические низкомолекулярные молекулы и ионы сопутствующих компонентов (сахара, аминокислоты, минеральные соли и т. п.) в силу огромных различий в коэффициентах диффузии практически полностью разделяются мембраной.

В качестве диализных мембран используют обычно пленки из целлюлозы - целлофан, купрофан, а также из других синтетических полимеров. Процесс проводят либо по проточной схеме (рис. 1.53, а), когда исходный раствор ферментов постоянно прокачивают с одной стороны мембраны, а диализирующую жидкость (обычно воду) - с другой ее стороны, либо по полупроточной схеме, когда раствор ферментов помещают на определенное время в мешочки из диализной мембраны, которые постоянно омываются водой. Таким образом можно удалить основную массу сопутствующих низкомолекулярных примесей и повысить активность ферментных растворов в пересчете на сухое вещество в несколько раз.

Процесс диализа применительно к очистке растворов ферментов имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, при диализе возможна «потеря» фермента в результате вымывания ионов металлов, входящих в состав молекулы фермента, или стабилизирующих фермент соединений, или фрагментов самого фермента, например, простетической группы его. Во-вторых, при диализе против обычной водопроводной воды может происходить потеря активности фермента в результате попадания из воды в раствор фермента ионов металлов - ингибиторов фермента. Следует также отметить, что в процессе диализа одновременно с очисткой происходит сильное разбавление ферментного раствора из-за проникновения воды под действием сил прямого осмоса в диализуемый раствор (см. рис. 1.53). Объем продиализованного раствора увеличивается примерно на 20-25%, а если учесть, что происходит активное удаление балластных веществ, то в результате диализа получают очень разбавленные ферментные растворы. Поэтому сейчас этот метод очистки ферментных растворов от балластных веществ в ферментной промышленности почти не используется. Этот метод иногда применяют в лабораторных исследованиях и при получении высокоочищенных ферментных препаратов.

 

Электродиализ

 

Если в процессе очистки ферментов стоит задача удалить из раствора электролитные примеси, т. е. органические и минеральные ионы, иногда пользуются электродиализом. Сущность этого мембранного метода в том, что перенос ионов через мембрану интенсифицируют с помощью постоянного электрического поля, а мембраны изготавливают из специальных ионо-обменных материалов на основе синтетических полимеров. Принципиальная схема работы электродиализаторов представлена на рис. 1.54.

Электрический потенциал к аппарату подводится через два электрода, размещенных в соответствующих электродных камерах. Обе камеры отделены от рабочей обессоливающей камеры, куда подается исходный pacтвор, ионообменными мембранами, со стороны катода - анионообменной, со стороны анода - катионообменной. При работе аппарата катионы под действием постоянного электрического поля смещаются к аноду, встречают на пути катионообменную мембрану, проходят через нее в электродную камеру и в виде слабого раствора щелочи выводятся из аппарата. Соответственно ведут себя и анионы, выходя из аппарата в виде слабого раствора кислоты. Обессоленный раствор ферментов (диализованный раствор) выводится из рабочей камеры.

Электродиализный метод осуществляется всегда в непрерывном режиме (см. рис. 1.54, б) и существенно более энергоемок, чем диализ. Применительно к обработке ферментных растворов он имеет те же недостатки. Кроме того, электродиализ нельзя применять при выделении ферментов, имеющих, например, четвертичную структуру, которая формируется с участием ионов металлов, а также при выделении металлоферментов, которые, как правило, теряют активность при электродиализе (α-амилазы, β-галактозидазы и др.).

 

Баромембранные методы

 

Часто баромембранные методы разделения жидких смесей относят к процессу обычной фильтрации, но они лишь внешне похожи благодаря тому, что движущей силой является разность давлений. В действительности с помощью полупроницаемых мембран разделяются истинные растворы, т. е. гомогенные системы, в то время как фильтрованием можно разделить лишь суспензии, т. е. твердую фазу отделить от жидкой.

Вместе с тем, считая мембранные методы фильтрованием на молекулярном уровне, можно построить условный спектр фильтрации, разместив мембранные методы - обратный осмос, нанофильтрацию, ультрафильтрацию и микрофильтрацию - в некоторый ряд и дополнив его обычной механической фильтрацией по порядку увеличения размера и молекулярной массы задерживаемых частиц (см. рис. 1.55).

Сегодня баромембранные методы получили широкое распространение в биотехнологической, пищевой, фармацевтической, химической промышленности. В частности, ни одно современное производство ферментов не может уже обойтись без ультрафильтрационной очистки и концентрирования продукта.

Физико-химический механизм. Растворение вещества в растворителе возможно только тогда, когда они имеют сродство друг к другу, т.е. когда на уровне межмолекулярного взаимодействия происходит сольватация молекулами растворителя молекул или ионов растворяемого вещества. Когда речь идет о водных растворах, процесс называется гидратация. Поскольку молекула воды представляет собой крохотный диполь, ее энергия связи с частицей растворимого вещества тем больше, чем больший заряд несет эта частица на себе. Понятно, что чем больше заряд иона, тем больше количество молекул воды окажется связанным с ионом в виде многослойной гидратной оболочки.

Именно образованием гидратных оболочек объясняется явление, которое называется прямой осмос (рис. 1.56). Если раствор любого вещества отделить полупроницаемой мембраной от объема чистого растворителя, то мы будем наблюдать односторонний перенос молекул растворителя (в данном случае воды) в раствор, где они достраивают гидратные оболочки. Чем выше концентрация растворенного вещества слева, тем больше молекул воды должно пройти через мембрану в раствор. Количественно этот перенос выражается величиной осмотического давления (Р _О ):

Р _О = C R Е,

где:

С - массовая концентрация растворенного вещества;

R - газовая постоянная;

Т - абсолютная температура.

Если осмотическое давление (Р _О ) больше гидравлического (Р _r ), то происходит прямой осмос, если Р _О = Р _r, то диффузия через мембрану прекращается.

Если же теперь к раствору приложить рабочее давление, превышающее осмотическое, т. е. Р _r > Р _О то начнется перенос молекул воды слева направо, т. е. будет происходить дегидратация раствора, концентрирование растворенного вещества и получение чистой воды в правой половине сосуда. Это механизм называется обратным осмосом.

Обратный осмос по механизму близок к ультрафильтрации. Ультрафильтрация год от года все шире используется в технологии ферментных препаратов. Весьма убедительны данные, приводимые фирмой «Амикон корпорейшн» (США) о преимуществах очистки и концентрирования методом ультрафильтрации (см. табл. 1.12).

 

Таблица 1.12

Метод разделения	Концентрация сухого вещества, %		Затраты на удаление 1 м^3 воды, доллары
	исходная	в концентрате
Центрифугирование	1-2	10-15	0,15-0,9
Гель-фильтрация	3-5	Разбавленная	6-30
Сушка барабанная	30	100	7,5
распылительная	10-20	100	15
лиофильная	10	100	60-90
Осаждение этиловым спиртом или солями	1-2	Различная	1500
Ультрафильтрация	1-10	10-50	0,15-0,30

 

Действительно, из таблицы следует, что ультрафильтрация обладает способностью не инактивировать ферменты и требует минимальные энергозатраты.

Скорость ультрафильтрации будет тем выше, чем больше разница между рабочим гидравлическом (Р _r) давлением и осмотическим.

Однако между процессами обратного осмоса и ультрафильтрации все же есть различия. Так, при обратном осмосе разделение низкомолекулярных веществ происходит при рабочем давлении до 0,7-14 МПа, так как осмотическое давление Р _О в этих растворах велико. При обратном осмосе используются мембраны с очень маленькими порами (от 1 • 10~4 до 2 • 10~3 мкм). При ультрафильтрации происходит разделение высоко- и низкомолекулярных соединений, и целью этого процесса является получение концентрата высокомолекулярных соединений (например, ферментов). Рабочее давление в этом случае низкое (от 0,07 до 0,7 МПа), так как Р _О небольшое. Величина пор мембран значительно больше - от 3 • 10~3 до 150 • 10~3 мкм.

Однако названные различия достаточно условны. Механизм процессов обратного осмоса и ультрафильтрации пока остается недостаточно ясным.

Для математического описания процесса мембранного разделения служит модель движения вязкого потока через поры (уравнение Пуазейля) и модель диффузионного массопереноса (закон Фика). Принято считать, что если размер пор мембраны меньше 3 • 10~3 мкм (обратный осмос), то процесс подчиняется закону Фика, если же размер пор больше 3 • 10~3 мкм (ультрафильтрация), то процесс подчиняется уравнению Пуазейля.

В этом и заключается принцип любого баромембранного процесса. Отличия между ними лишь в размерах пор используемой мембраны и в величинах приложенного к раствору давления.

Поскольку осмотическое давление белковых растворов мало, для осуществления процесса достаточно 0,3-0,6 МПа, а размер пор мембраны составляет 10-50 нм. На основе этих знаний каждый может теперь дополнить диаграмму на рис. 1.55 новыми системами.

 

ПРИМЕНЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ

Антибиотические вещества находят применение в различных отраслях народного хозяйства, в научных исследованиях. Они широко используются в медицине, в сельском хозяйстве, в пищевой и консервной промышленности, как специфические ингибиторы в биологических исследованиях.

Антибиотики в медицине. Открытие антибиотиков вызвало переворот в медицине. Многие антибиотические вещества оказались незаменимыми лечебными препаратами. Они нашли широкое применение при лечении многих инфекционных заболеваний, которые ранее считались неизлечимыми или сопровождались высоким летальным исходом. К числу таких заболеваний необходимо отнести некоторые формы туберкулеза и, прежде всего туберкулез менингитный, который до применения антибиотиков вызывал 100%-ный летальный исход, чуму, азиатскую холеру, брюшной тиф, бруцеллез, пневмонию, различные септические процессы и др.

Некоторые антибиотики способны подавлять развитие злокачественных опухолей и проявлять активность в отношении ряда вирусов.

К настоящему времени в медицинской практике нашло применение около ста антибиотиков. Поиски новых антибиотических веществ, получение ценных полусинтетических препаратов антибиотиков расширяют возможность их практического применения в медицине.

Антибиотики в сельском хозяйстве. Наряду с медицинским использованием антибиотики находят широкое применение в сельском хозяйстве. Прежде всего, антибиотики используются в качестве препаратов в ветеринарии для лечения различных заболеваний сельскохозяйственных животных. В этом случае они, как и в медицине, оказались весьма эффективными средствами.

Антибиотические вещества находят все возрастающее применение в борьбе с фитопатогенными организмами - возбудителями заболеваний растений, наносящими ощутимый урон сельскохозяйственному производству.

При выборе антибиотиков, используемых в растениеводстве, необходимо руководствоваться следующими основными требованиями к препарату:

1) антибиотик должен обладать специфической биологической активностью к возбудителю заболевания растений;

2) он должен легко проникать в ткани растений и проявлять внутри них биологическую активность;

3) лечебные дозы антибиотика должны быть безвредными для растения;

4) антибиотик, находясь на поверхности и внутри тканей растения, должен относительно длительное время проявлять биологическую активность, но должен также легко и быстро инактивироваться, попадая в почву.

Одним из самых главных требований к антибиотикам, используемым в сельском хозяйстве, должно быть то, чтобы эти препараты не применялись в медицинской практике. Это принципиальное условие обеспечивает снижение уровня появления резистентных форм микроорганизмов, патогенных для человека.

Для борьбы с фитопатогенными организмами могут применяться различные антибиотики.

Гризеофульвин - образуется плесневыми грибами из рода Penicillum (P. urticae, P. nigricans, P. rustrichi). Строение антибиотика см. с..

Гризеофульвин применяют против фитопатогенных грибов и, прежде всего грибов, относящихся к роду Botrytis. Он активен в отношении возбудителя ржавчины, мучнистой росы, килы капусты.

Трихотецин - продуцируется плесневым грибом Trichothecium roseum (см. с.).

Антибиотик подавляет развитие ряда фитопатогенных грибов, в том числе Botrytis cinerea, Helmintosporium. Попадая в почву, трихотецин инактивируется ферментом трихотециназой, образуемой почвенными грибами из рода Fusarium, Aspergillus, Penicillum.

Касугамицин, продуцируемый Streptomyces kasugaensis, имеет следующее строение:

 

Активен против грибного заболевания риса пирикуляриоза, широко распространенного в Японии. Заболевание вызывается грибом Pericularia oryzae.

Полиоксины - антибиотики, относящиеся к своеобразным соединениям пептидил-пиримидин-нуклеозидам, обладают противогрибковой активностью. Образуются культурой Streptomyces cacaoi и имеют следующее строение:

Антибиотики подавляют рост фитопатогенных грибов из рода Alternaria, Cochliobalus, Pirularia.

Валидамицин А, образуемый Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, обладает биологической активностью против фитопатогенного гриба Rizoctonia solani - возбудителя заболевания риса. Известна суммарная формула валидамицина A: C₂₀H₃₅NO₁₃∙H₂O. Антибиотик легко разлагается почвенными микроорганизмами.

Тетранастин - антибиотическое вещество актиномицетного происхождения. Его продуцентом является Streptomyces aureus. Обладает специфической активностью против паразитарных паучков и клещей плодовых деревьев.

Гербицидины А и В, синтезируемые Streptomyces saganoensis, подавляют развитие возбудителя заболевания риса, вызываемое Xanthomonas oryzae.

Гербицидин А задерживает прорастание семян риса и китайской капусты, обладает избирательной гербицидной активностью против двудольных растений.

Гербицидины А и В по химическому строению и биологической активности близки к тойокамицину, образуемому культурой S t r. toyocaensis.

 

Антибиотики в пищевой и консервной промышленности. При борьбе с микроорганизмами, вызывающими порчу продуктов питания, наряду с физическими и химическими методами применяются и антибиотики. Однако для этих целей не могут быть использованы антибиотики, применяемые в медицине. Это правило введено в нашей стране и ряде других государств и связано оно с предупреждением процесса возникновения и распространения устойчивых к антибиотикам форм микробов.

Среди антибиотиков, применяемых в пищевой и консервной промышленности, можно назвать субтилин, низин и некоторые другие.

Субтилин образуется культурой Bacillus subtilis и представляет собой полипептид. Активен в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе и кислотоустойчивых бацилл.

Применяя субтилин при консервировании овощей, можно значительно смягчить их термическую обработку, что имеет большое значение для сохранения витаминов, вкусовых качеств и консистенции продукта.

Низин - высокомолекулярный пептид, а может быть даже низкомолекулярный белок, образуемый Streptococcus lactis.

Низин не используется в медицинской практике. Его применяют при консервировании томатов, зеленого горошка, цветной капусты и других продуктов. Хорошие результаты получены при сохранении сыров.

Антибиотик подавляет развитие ряда термофильных спорообразующих бактерий, не токсичен для человека.

Применение антибиотиков в растениеводстве, пищевой и консервной промышленности должно происходить под постоянным и строгим контролем специалистов и соответствующих компетентных органов.

СУШКА АНТИБИОТИКОВ

 

Вследствие нестабильности антибиотиков даже в слабо увлажненном состоянии их выпускают в хорошо высушенном состоянии - с остаточной влажностью 0,5-2,0%. В зависимости от агрегатного состояния антибиотика в конце очистки и его стабильности при повышении температуры применяют четыре метода сушки:

1) осажденные в виде кристаллов антибиотики, имеющие сравнительно высокую стабильность (например, тетрациклиновые), подвергаются сушке при атмосферном давлении и температуре до 90° С в камерных или пневматических сушилках;

2) осажденные малостабильные антибиотики (пенициллины) высушиваются в вакуумных сушилках при техническом вакууме и температуре около 40° С - шкафах, сушилках-венулет и др.

Антибиотики, полученные при выделении-очистке в виде концентрата, т.е. 5-15% водного раствора (стрептомицин, антибиотики группы неомицина), весьма нестабильные в растворенном состоянии, подвергаются сушке двумя методами, исключающими инактивацию и ухудшение качества препаратов;

3) медленная сушка (в течение нескольких часов) при отрицательной температуре путем сублимации воды из замороженного раствора под средним или глубоким вакуумом; эту сушку называют молекулярной;

4) скоростная сушка (в течение долей секунды) при высоких температурах порядка 130° в виде аэрозоля, образованного из раствора в токе горячего воздуха; эту сушку называют распылительной.

Молекулярная сушка. Метод сублимационной сушки впервые был открыт и запатентован в 1921 г. советским инженером Г. И. Лаппа-Старженецким. Метод заключается в том, что влажный материал или раствор (бактериальная масса, сыворотка крови, раствор антибиотика, фруктовый сок, фрукты, мясо, рыба), замороженные до температуры минус 20-40° С сушатся в вакууме с остаточным давлением около 0,01 мм рт. ст., путем возгонки воды из кристаллов льда.

При этом благодаря вакууму средняя длина свободного пробега молекул воды в порах высушиваемого материала (≈ 5 мм) значительно больше поперечника капиллярных пор (10^-4 - 10^-2 мм) замороженного материала, по которым удаляются пары воды. В этих условиях молекулы воды движутся в порах в виде молекулярных пучков (эффузия). Поэтому сублимационный метод сушки, по предложению А. В. Лыкова, назван молекулярной сушкой.

Технология молекулярной сушки заключается в следующем. Раствор антибиотика, чтобы не допустить его вспенивания в сублимационной камере и выброса в вакуумную систему, предварительно замораживают в камерах обычных холодильных установок до температуры -40° С. Перед замораживанием раствор стерилизуют фильтрацией и разливают во флаконы с помощью полуавтоматического дозатора по 3-5 мл в зависимости от клинической дозы антибиотика. Чем быстрее происходит замораживание, тем более мелкокристаллической и более гомогенной по концентрации антибиотика становится структура образующегося льда и тем быстрее идет последующая сушка благодаря более развитой поверхности сублимации.