Концентрирование и очистка вирусов

Осаждение солями. Вирусы, подобно белкам, осажда­ются из водных растворов при определенных концентра­циях солей, которые разрушают взаимодействие между молекулами воды и полярными группировками оболочки вируса. Вирус агрегирует и выпадает в осадок. Наиболее часто для этого применяют сульфат аммония.

Несмотря на простоту и дешевизну, метод высалива­ния сульфатом аммония обладает двумя недостатками. Во-первых, он неспецифичен для вирусов, поскольку вместе с ними высаливаются и белки клетки-хозяина, во-вторых, при этой процедуре происходит деструкция не­которых вирусов.

Осаждение в изоэлектрической точке. Большинство вирусов преципитирует в кислой зоне pH, поскольку их изоэлектрические точки лежат в пределах 3,5-6,5.

Осаждение в изоэлектрической точке – наиболее прос­тая и доступная операция из всех применяемых методов концентрирования и очистки вирусов. Однако при pH ни­же 5,0 также выпадают в осадок многие белки клетки-хо­зяина, что ограничивает возможность применения этого метода. К тому же подобная процедура не всегда жела­тельна при очистке некоторых лабильных вирусов.

Осаждение спиртами. При добавлении к вируссодер­жащей суспензии охлажденного метанола или этанола ви­рус преципитирует вследствие уменьшения (как и в рас­смотренном выше случае обработки сульфатом аммония) степени гидратации его белковой оболочки. Оптимальная концентрация спирта для каждого вируса подбирается эм­пирически. Эта величина колеблется от 15 до 35%. Проце­дура проводится при максимально возможных низких температурах для избежания денатурации вирусных час­тиц. Метанол более выгодно использовать, чем этанол, так как, применяя его, можно работать при более низких тем­пературах.

Однако этот метод так же, как и метод высаливания суль­фатом аммония, имеет недостатки. Он неспецифичен для вирусов (осаждается значительное количество балластных белков) и не может быть использован для некоторых виру­сов животных, которые не устойчивы к спиртам (сложные вирусы, содержащие липопротеидные оболочки).

Обработка ферментами. Благодаря особой структур­ной организации вирионов, большинство вирусов, несмот­ря на их нуклеопротеидную природу, устойчиво к действию протеолитических ферментов и нуклеаз, в то время как клеточные нуклеиновые кислоты и белки легко разрушаются этими ферментами. Используя эту различ­ную чувствительность вируса и клеточных примесей к ферментам, можно при помощи ферментов провести час­тичную очистку вирусов.

Ультрафильтрация. Метод концентрирования и очист­ки вирусов с помощью мембранных ультрафильтров име­ет преимущества перед другими методами, как один из наи­более мягких и щадящих. Мембранные фильтры изготав­ливают из этерифицированной целлюлозы. Размер пор у фильтров разных типов варьирует от 0,01 до 8 мк. Фильт­ры устойчивы к температуре (до 125°С), к воздействию разбавленных кислот и щелочей и неполярных раствори­телей. В идеале, используя последовательную ультра­фильтрацию через две мембраны с убывающим размером пор (одна задерживает частицы более крупные, чем вирус, а вторая – только вирус), можно получить в чистом виде любой вирус. Недостатком метода является то, что часто происходит засорение фильтра или адсорбция вируса на фильтре.

Разделение в двухфазных системах. Метод основан на том, что распределение веществ в водной полимерной двухфазной системе зависит от их размера и поверхност­ных свойств и характеризуется определенным коэффици­ентом распределения. Например, вирусы и примеси в сис­темах, содержащих декстран и полиэтиленгликоль, име­ют разные коэффициенты распределения между двумя фазами. Поэтому в одной фазе собирается вирус, а в дру­гой – примеси. Метод прост и не требует сложного обору­дования. Преимущество его состоит также в том, что кон­центрирование и очистка вируса производятся в «мяг­ких» условиях. Кроме того, можно обрабатывать большие количества вируссодержащего материала.

Вопрос 52