Определение процента живых и мертвых спермиев с помощью дифференциальной окраски по Морозову.

Дополнительная методика, более точная, чем определение активности.

При смешивании спермы с водным раствором эозина живые спермии не окрашиваются, а мертвые и слабые (с колебательным движениями) окрашиваются

Для определения % живых и мертвых спермиев в эякуляте каплю спермы наносят на край обезжиренного предметного стекла (на электрообогревательном столике), добавляют 2-3 капли 3-5% теплого водного раствора эозина, быстро смешивают, делают тонкий мазок. Для приготовления мазка можно использовать специальное шлифовальное стекло либо покровное. Мазок подсушивают на воздухе, просматривают под микроскопом. При этом головки сперматозоидов, бывших до приготовления мазка живыми, будут светлыми, а головки мертвых сперматозоидов окрашиваются в розовый цвет.

В нескольких полях зрения микроскопа подсчитывают 500 спермиев. Высчитывают % живых по формуле:, гдеn – число живых спермиев из 500 подсчитанных. Если %ж = 80 – 8 баллов активности.

При определении процента живых и мертвых спермиев у жеребца рекомендуется использовать краситель конго-рот, при это на 100 мл 7% раствора глюкозы (изотоничного для спермиев) добавляют 1г красителя.

Метод определения процента патологических форм спермиев

Существует прямая связь между клиническими симптомами заболеваний производителей и процентом патологических форм спермиев в их сперме. Данный метод позволяет определить оплодотворяющую способность сперматозоидов. Дополнительный метод.

Методика

Сперму барана разбавляют раствором NaCl 0,9% или 2,9% раствором цитрата натрия в 20-30 раз. Сперму быка разбавляют в 10-15 раз, густую сперму кобеля, хряка и жеребца в 2-3 раза.

На край предметного стекла наносят каплю исследуемой спермы. Шлифовальным стеклом делают тонкий мазок, его сушат на воздухе, фиксируют 96% этиловым спиртом 1-2 минуты. Споласкивают водой и окрашивают 1-2% раствором эозина, фуксина, 0,1% метиленового синего. При этом перед окрашиванием на мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, на которую и наносят краситель на 1-2 минуты. Бумажку убирают, раствор краски смывают водой, подсушивают мазок на воздухе. Затем рассматривают его под микроскопом (увеличение в 500-600 раз), подсчитывают 200 клеток. При этом определяют, сколько из них имеют различные отклонения от нормального строения.

Группы: нормальные, гигантские, карликовые, с деформацией головки, с надломом у шейки, свободные головки и бесхвостые спермии, с закручиванием хвоста и ненормальным его изменением, с цитоплазматической каплей, утолщением и ненормальным искривлением хвоста, прочие патологические формы – всего 8 групп.

В сперме производителей с клинически выраженным поражением семенников процент спермиев с патологической головкой, карликовых очень высок. Сперма непригодна для осеменения.

Патология придатка: загнутый в виде петли хвостик, надлом в области головки. Появление вышеперечисленных патологических форм указывает на то, что при нормальном спермиогенезе в канале придатка создаются неблагоприятные условия для половых клеток, в результате чего они разрушаются. Петлеобразный изгиб – при изменении осмотического давления в придатке в результате присутствия патологических секретов.

При гнойном воспалении придаточных половых желез, но при нормальной функции семенников и придатков в сперме вместе с нормальными клетками гной. У таких самцов в сперме патологических форм немного, но при просмотре под микроскопом – лейкоцитоз.

Спермии с наличием цитоплазматической капли и утолщением в области головки появляются при нарушении спермиогенеза. % патологических форм спермиев принято определять 3-4 раза в год. Обязательным это мероприятия является при резком снижении качества получаемой спермы.

 

Требования к разбавителям для спермы.

Для этого необходимо разбавить сперму, чтобы увеличить ее объем и обеспечить сохранность оплодотворяющей способности на продолжительный срок.

Разбавляют сперму специальными средами — биологическими и синтетическими. Главные требовании к среде — это создание условии, которые предупреждали бы расходование внутренних энергетических запасов в спермиях, обеспечили способность длительной выживаемости вне организма и сохранности их оплодотворяющей способности.