Гигиенические и эпидемиологические показания к проведению санитарно-вирусологического контроля качества водных объектов

Гигиенические и эпидемиологические показания к проведению санитарно-вирусологического контроля качества водных объектов

Объекты исследования

Объектами исследования является вода различных водных объектов:

• сточная;

• сточная на этапах очистки и обеззараживания;

• пресных и морских поверхностных водоемов, используемых в рекреационных целях, а также в качестве источников хозяйственно- питьевого водоснабжения;

• плавательных бассейнов;

• подземных водоисточников;

• питьевая (водопроводная; вода, расфасованная в ёмкости и др.);

• из децентрализованных водоисточников.

2.2.1. Сточные воды

Сточные воды, поступающие на очистные сооружения, исследуют с целью изучения спектра энтеровирусов, циркулирующих среди населения, и по эпидемическим показаниям.

Сточные воды на этапах очистки и обеззараживания исследуют для изучения эффективности работы очистных сооружений в отношении возбудителей кишечных вирусных инфекций в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.5.980-00«Гигиенические требования к охране поверхностных вод».

2.2.2. Вода поверхностных водоемов

Воду пресных водоемов исследуют на наличие вирусного загрязнения с целью изучения процессов самоочищения, при выборе поверхностных водоемов в качестве водоисточников для централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, установления зон санитарной охраны, по эпидемическим показаниям.

Контроль воды морских и пресных водоемов за уровнем загрязнения осуществляют при использовании их в рекреационных целях в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами СанПиН 2.1.5.980-00 «Гигиенические требования к охране поверхностных вод», по эпидемическим показаниям.

2.2.3. Вода подземных водоисточников

Воду подземных водоисточников исследуют на наличие вирусного загрязнения при выборе источника хозяйственно-питьевого водоснабжения, контроле ее качества в соответствии с ГОСТ 2761-84 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения», по эпидемическим показаниям.

2.2.4. Вода плавательных бассейнов и аквапарков

Контроль за уровнем вирусного загрязнения воды плавательных бассейнов проводят в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.2.1188-03 «Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества», СанПиН 2.1.2.1331-03 «Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству вод аквапарков», по эпидемическим показаниям.

2.2.5. Вода питьевая

Питьевую воду исследуют на наличие вирусного загрязнения в соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил и нормативовСанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества», СанПиН 2.1.4.1116-02 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в ёмкости. Контроль качества», в соответствии с программой исследования воды, утвержденной главным государственным санитарным врачом города, района, субъекта Российской Федерации, по эпидемическим показаниям.

2.2.6. Контроль воды децентрализованных источников

Исследование воды децентрализованных источников проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативамиСанПиН 2.1.4.1175-02 «Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана водоисточников», по эпидемическим показаниям.

Основные материалы, оборудование, питательные среды

…

Таблица 2

Чувствительность перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам

Вирусы	Проявление цитопатогенного эффекта на культуре клеток
	RD	Нер-2	BGM	L20B
Полиомиелита 1-3	+	+	+	+
ECHO	+	-	±+	-
Коксаки А	±, за исключением Al, A19 А22	-	-	± (Коксаки А 2-6, 8, 10, 14)
Коксаки В	-	+	+	-
Энтеровирусы 68-71	±	-	-	-
+ - наличие цитопатогенного эффекта;
- отсутствие его;
± - может быть.

Культуры клеток для лабораторного исследования следует получать из аттестованного источника, например, из лаборатории, обладающей банком клеток. Необходимо периодически контролировать чувствительность используемых в лаборатории клеток. Для этого после каждых 8-10 пассажей клеток на них проводят титрование референс-штаммов вакцинного вируса полиомиелита. После 15-20 последовательных пассажей следует перейти на свежую линию из банка клеточных культур или получить её в референс-лаборатории. Эта процедура позволяет сохранять высокую чувствительность клеток и снижает риск контаминации клеток микоплазмами.

Для исследования одной пробы используют не менее двух культур клеток площадью не менее 75 см². Это соответствует трём флаконам ёмкостью 50,0 мл (поверхность каждого флакона составляет 25 см²). Два из этих флаконов должны быть с культурой клеток RD, один - с любой другой из рекомендованных культур. Флаконы со свежеобразованным монослоем клеток микроскопируют для того, чтобы убедиться в здоровом состоянии клеток. Монослой клеток, подходящий для заражения, обычно формируется в течение 2-3 дней после «посадки» клеток на флаконы при концентрации клеток 1×10⁶ мл ростовой среды. После замены ростовой среды на 4,5 мл поддерживающей среды (без сыворотки) флаконы маркируют (указывают номер пробы, дату заражения, номер пассажа). В каждый флакон вносят по 0,5 мл обработанной исследуемой пробы воды. Все используемые клеточные линии следует инокулировать одновременно. Обязательно оставляют по 1 незаражённому контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре 36 °С. Ежедневно, обычно в течение 5-7 дней, проверяют культуры на наличие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75 % клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при 20 °С для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы никогда не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый «слепой» пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают в течение не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ в течение этого срока культуры отбрасывают как негативные.

При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью, или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

При выделении вирусов из проб воды различного происхождения в культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1-2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20 °С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует вернуться к исходной пробе, развести её ФСБ 1:10 и повторить заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к исходной пробе, обработать её хлороформом и повторить процедуры заражения.

Особое внимание следует уделять предупреждению перекрёстной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); по возможности не рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки, целесообразно использовать посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.

Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изолятов. Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все изоляты, «положительные» на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также неполио-энтеровирусы могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для заключительного исследования.

В лабораторной практике часто используют метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре 36 °С в течение 1 ч. Таким образом, создают лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ, по крайней мере, на 1 сутки. Следует иметь ввиду, что при использовании этого метода, в результате дополнительных открываний крышек, во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрёстной вирусной или бактериальной). Его рекомендуется проводить в ламинарном шкафу. Ввиду высокого риска контаминации этот метод не следует использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.

Постановка реакции обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции и электрофоретический анализ продуктов полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции-амплификации (ОТ-ПЦР-амплификации)

Рекомендуется использовать ПЦР-тест-системы на вирус гепатита А и ротавирусы с электрофорезом в агарозном геле (кат. № V4-50-R0,5; V4-50-R0,2; V15-50-R0,5; 15-50-R0,2), разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.

Таблица 3

На каком этапе используется	Название	Последовательность
Обратная транскрипция	НП1 (прямой)	5'-cgcctgttttataccccctcccccaa-3'

Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, входят в состав готовой стандартной тест-системы.

8.6.3.2. Расчет рабочих концентраций праймеров.

Поставку праймеров производителем осуществляют в количествах, измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) на мл. Для расчета рабочих концентраций праймеров необходимо перевести ОЕ в мкМ. Для праймера, длиной А пар нуклеотидов (п.н.), поставляемом в количестве В ОЕ, пересчет осуществляют следующим образом:

• определяют молекулярную массу (ММ) одноцепочечной ДНК (оцДНК) по формуле

ММ = 330 дальтон (ММ 1 п.н.) × А;

• определяют концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ оцДНК соответствует концентрации 37 мкг/мл, соответственно В ОЕ соответствуют концентрации 37 × В мкг/мл;

• определяют концентрацию праймера С в мкМ

С = (37 × В × 1000) / (330 × А) (мкМ).

Ряд организаций-производителей обратной транскриптазы в инструкциях по постановке реакции обратной транскрипции указывают не концентрацию праймеров в мкМ, а количество праймера, добавляемое в реакцию (в pmol). В этом случае пересчет ОЕ в pmol следует производить по формуле

D = B /(0,01 × А), где

D - количество праймера (в pmol), содержащееся в 1 мкл раствора.

8.6.3.3. Постановка реакции обратной транскрипции.

Для обратной транскрипции можно использовать готовые стандартные наборы реагентов, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. В состав наборов входят буферный раствор и фермент - обратная транскриптаза (ревертаза) различного происхождения. Ингибитор РНКаз и смесь ДНТФ некоторые производители поставляют отдельно. Все компоненты реакционной смеси для обратной транскрипции можно приобретать по отдельности.

Постановка:

• в 0,2 мл (или 0,5 мл) пробирки вносят: 10,0-14,5 мкл РНК пробы, 10-20 pmol прямого праймера НП1;

• смесь аккуратно перемешивают, осаждают центрифугированием (5 с при 5 000 об./мин или с использованием вортекса) и помещают в термоциклер на 70 °С 10 мин;

• по истечении времени нагревания пробирки достают и помещают на лед;

• в пробы добавляют: 5х или 10х буфер для обратной транскрипции (конечная концентрация - 1х), 1 мкл ДНТФ (100-200 мкМ), обратную транскриптазу (100-200 ед.), ингибитор РНКаз (20 ед.). Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. Объем реакционной смеси при необходимости доводят с помощью свободной от РНКаз воды;

• смесь перемешивают, осаждают центрифугированием и выдерживают при комнатной температуре 10-15 мин;

• пробирки помещают в термоциклер и выдерживают 50 мин при 37-42 °С (время и температуру, необходимые для работы фермента, указывают в инструкции производителя).

После синтеза кДНК на РНК матрице пробы используют для ПЦР-амплификации.

8.6.3.4. Полимеразная цепная реакция.

Амплификацию полученной в реакции обратной транскрипции кДНК осуществляют с использованием тест-системы для амплификации участка кДНК энтеровирусов длиной 207 п.н. (кат. № V-16-100-R0,5 или Кат. № V-16-100-R0,2) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

8.6.4. Анализ амппифицированной ДНК, учет результатов

Для анализа амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из которых является гель-электрофорез. Для постановки электрофореза можно использовать комплект стандартных реагентов для электрофореза в агарозном геле (кат. № К5-200) в соответствии с инструкцией производителя.

Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель, либо достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора, либо используют емкости из УФ-проницаемых материалов.

При постановке ОТ-ПЦР для выявления в пробе «минус» цепи РНК энтеровирусов, положительные образцы должны содержать полосу ДНК размером 207 п.н. Размер полосы определяют по соотношению с положительным контролем и ДНК-маркером. Результаты можно документировать посредством фотографирования или видеосъемки геля с использованием ультрафиолетовых фильтров.

8.6.5. Интерпретация результатов, полученных с использованием культур тканей методом ОТ-ПЦР

Выявление негативной РНК («минус» цепи РНК) энтеровирусов в пробе исследуемой воды с помощью ОТ-ПЦР зараженных культур клеток свидетельствует о присутствии в ней инфекционных энтеровирусов и интерпретируется как положительный результат молекулярного теста на инфекционность энтеровирусов.

Гигиенические и эпидемиологические показания к проведению санитарно-вирусологического контроля качества водных объектов