Относительная количественная оценка, нормализованная к

Эталонный ген

Преимущество использования эталонного гена (такого как GAPDH, β-актин и др.) Скорее

чем единица массы в качестве нормализатора является то, что этот метод обходит необходимость

точное количественное определение и загрузка исходного материала. Это особенно

удобно при проведении экспериментов по относительной экспрессии генов, когда

материал часто ограничен. Недостатком является то, что этот метод требует

наличие известного эталонного гена или генов с постоянной экспрессией во всех

образцы проверены и чья экспрессия не изменяется при обработке

исследование. Идентификация такого эталонного гена не тривиальна, и в последнее время

Было предложено, что в большинстве случаев использование нескольких эталонных генов может

необходим для точного количественного определения (см. Vandesompele et al., Genome Biology 3,

исследование 0034.1–0034.11, 2002, для подробного обсуждения).

Как обсуждалось в предыдущем разделе, при сравнении нескольких образцов

относительное количественное определение, один из образцов обычно выбирается в качестве калибратора,

и экспрессия гена - мишени во всех других образцах является выражено как

увеличить или уменьшить относительно калибратора. Обычно, необработанные или

Исходный образец выбран в качестве калибратора. В случае примера p53,

мы можем выбрать нормальные клетки яичников в качестве калибратора и раковых

клетки яичников в качестве тестового образца. Определить относительное выражение цели

ген в тестовом образце и образце калибратора, используя эталонный ген (ы) в качестве

нормализатор, уровни экспрессии как целевого, так и эталонного генов необходимы

определяется с помощью RT-КПЦР. Короче говоря, вам нужно определить значения C T,

как показано в таблице 4.2.

Таблица 4.2. Значения C T, необходимые для относительного количественного определения с эталонным геном

как нормализатор.

Тестовое задание

Калибратор (кал)

Целевой ген

C T (цель, тест)

C T (цель, кал)

Эталонный ген

C T (ссылка, тест)

C T (ref, cal)

После того, как значения C T измерены, различные методы могут быть использованы для определения

уровень экспрессии целевого гена в тестируемом образце относительно калибратора

образец. В следующих разделах мы представляем три метода относительного количественного определения

с использованием контрольного гена: 1) метод Ливака, также известный как метод 2 –∆∆C T, 2)

метод ∆C T с использованием эталонного гена и 3) метод Pfaffl. Каждый метод

имеет преимущества и недостатки, а также предположения, которые должны быть выполнены

чтобы результаты анализа были действительными.

Страница 45

количественный анализ данных ПЦР

относительная количественная оценка

4.2.3.1 Метод 2 - ∆∆ C T (Livak)

Метод 2 –∆∆C T для анализа относительной экспрессии генов широко используется и прост

выполнять. Этот метод предполагает, что и целевой, и эталонный гены

усиливается с эффективностью около 100% и в пределах 5% друг от друга. Перед использованием

метод 2 –∆∆C T, важно проверить допущения, определив

Эффективность амплификации мишени и эталонных генов. Усиление

Эффективность мишени и эталонного гена можно определить методом

изложенные в разделе 1.1.3.

После того, как вы установили, что целевой и эталонный гены имеют сходные и

почти 100% эффективности, вы можете определить относительную разницу в

Уровень экспрессии целевого гена в разных образцах, используя следующие шаги:

Во-первых, нормализуйте C T гена-мишени по сравнению с эталонным (ref) геном, для обоих

тестовый образец и калибратор образца:

∆C T (тест) = C T (цель, тест) - C T (ссылка, тест)

∆C T (калибратор) = C T (цель, калибратор) - C T (ссылка, калибратор)

Во-вторых, нормализуйте ΔC T испытуемого образца до ΔC T калибратора:

∆∆C T = ∆C T (тест) - ∆C T (калибратор)

Наконец, вычислите коэффициент выражения:

2 –∆∆C T = нормализованный коэффициент экспрессии

Полученный результат представляет собой кратное увеличение (или уменьшение) целевого гена в тесте

образец относительно калибратора образца и нормируется на выражение

эталонный ген. Нормализация экспрессии целевого гена по сравнению с

Эталонный ген компенсирует любую разницу в количестве образца ткани.

Если мишень и эталонные гены не имеют одинаковой эффективности амплификации

Вы можете либо оптимизировать, либо перепроектировать анализы, либо использовать метод Pfaffl.

описано в разделе 4.2.3.3. Если, с другой стороны, цель и ссылка

гены имеют одинаковую эффективность амплификации, но эффективность не равна 2,

можно использовать модифицированную форму метода 2 –∆∆C T, заменив 2 в

уравнение по фактической эффективности усиления. Например, если усиление

Эффективность как мишени, так и эталонного гена составляет 1,95, формула 1.95 –∆∆C T

должен быть использован.

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

41

Страница 46

анализ данных КПЦР в реальном времени

относительная количественная оценка

© 2006 Bio-Rad Laboratories, Inc. Все права защищены. Руководство по применению ПЦР в реальном времени

42

Следующий гипотетический пример демонстрирует, как метод 2 –∆∆C T используется для

определить относительную экспрессию целевого гена (р53) в раковой и нормальной

клетки яичников.

Пример: кДНК, представляющие 50 нг общей РНК, выделенной как из нормальной, так и из

Опухолевые клетки яичника анализировали на p53 (целевой ген) и GAPDH (ссылка

ген) сообщение. GAPDH может служить эталонным геном для этого исследования, потому что

предыдущие исследования показали, что экспрессия GAPDH не изменяется между нормальными

и опухолевые клетки. Значения C T для каждого образца приведены ниже:

Образец

C T p53 (цель)

C T GAPDH (ссылка)

Нормальный (калибратор)

15,0

16,5

Опухоль (тест)

12,0

15,9

Чтобы вычислить относительное выражение, используя шаги, описанные выше, С Т из

целевой ген нормализован по отношению к C T эталонного гена для обоих тестируемых образцов

и образец калибратора:

∆C T (в норме) = 15,0 - 16,5 = –1,5

∆C T (опухоль) = 12,0 - 15,9 = –3,9

Во-вторых, ∆C T испытуемого образца нормируется на ∆C T калибратора:

∆∆C T = ∆CT (опухоль) - ∆CT (нормальное состояние)

= –3,9 - (–1,5) = –2,4

Наконец, коэффициент выражения вычисляется:

2 –∆∆C T = 2 - (- 2,4) = 5,3

Опухолевые клетки экспрессируют р53 в 5,3 раза выше, чем нормальные клетки.

4.2.3.2 Δ С

T