Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ:  Археология Биология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия ЭкологияТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву 
Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Определение ферментации лактозы
Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной колонии засевают в две пробирки с полужидкой лактозной средой и жидкой лактозо-пептонной средой (ЛПС). В состав жидкой лактозо-пептонной среды (ЛПС) входят 10 г пептона, 5 г натрия хлорида и 5 г лактозы, которые растворяют при нагревании Для приготовления среды накопления (концентрированной ЛПС), используя титрационный метод, увеличивают количество всех ингредиентов (кроме воды) в 10 раз и разливают по 10 см3 во флаконы с поплавками. Перед стерилизацией в ЛПС, используемую для подтверждения способности бактерий к ферментации лактозы до кислоты и газа, добавляют 1,6% спиртовой раствор бриллиантового синего из расчёта 1 см3 красителя на 1 л ЛПС (при образовании кислоты зелёный цвет ЛПС изменяется на жёлтый). Для работы мембранным методом готовую ЛПС разливают по 3-5 см3 в пробирки с поплавками. Для обнаружения ОКБ посевы в ЛПС с индикатором инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч. Для обнаружения ТКБ посевы инкубируют при температуре 44 °С в течение 24 ч. При обнаружении кислоты и газа результат исследования считают положительным. При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты через 24 ч пробирки оставляют в термостате до 48 ч. При положительных результатах КОЕ ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 см3 воды. Вычисления проводят по формуле: Х= а×100/v, где Х – число колоний в 100 см3; а – число подсчитанных на фильтрах колоний в сумме; v – объем воды, профильтрованный через фильтры. Окончательный результат выдают в следующем формате: количество КОЕ ОКБ в 100 см3, из них – количество КОЕ ТКБ в 100 см3.
3. Определение спор сульфитредуцирующих клостридий методом прямого посева
Метод основан на выращивании посевов в железо-сульфитном агаре в условиях, приближённых к анаэробным, и подсчёте числа чёрных колоний. На первом этапе исследования пробу воды объёмом 20 см3 прогревают на водяной бане в пробирках при температуре 75 °С в течение 15 мин для уничтожения вегетативных форм микроорганизмов. Затем в 4 стерильные пробирки объёмом не менее 15 см3 вносят по 5 см3 подготовленной пробы воды и заливают горячим, расплавленным на водяной бане (не кипятить!) железо-сульфитным агаром по 10 см3 в каждую пробирку. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают в ёмкости с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при температуре 44 °С в течение 16-18 ч.
Количественному учёту подлежат те посевы, где получены изолированные чёрные колонии в толще питательной среды. Результат выражают числом КОЕ спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см3 воды. В случае сильного роста результат оценивают качественно и в протоколе отмечают: «Обнаружено в 20 см3 воды». При отсутствии роста чёрных колоний дают ответ: «Не обнаружено в 20 см3 воды».
Заключение _________________________________________________
4. Определение коли-фагов
Метод определения коли-фагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении их в среде обогащения на культуре Е. coli и последующем выявлением зон лизиса (просветления) газона Е. coli на питательном агаре. Метод предназначен дли проведения текущего контроля качества питьевой воды. На всех этапах исследования используют бактериальную взвесь, при-готовленную следующим образом: эталонную тест-культуру Е. coli К-12 F+ Smr засевают в пробирку со скошенным питательным агаром. Через 18 ч инкубации при температуре 37 °С проводят смыв бактерий с косого агара 5см3 0,9% раствором натрия хлорида и по стандарту мутности готовят взвесь Е. coli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1см3. Можно использовать 4-часовую бульонную культуру Е. coli, 2 см3 такой культуры содержат 109 бактериальных клеток. В начале исследования 100 см3 исследуемой пробы воды разливают на 6 объёмов: один флакон 50 см3 и 5 пробирок по 10 см3. В 50 см3 пробы воды добавляют 5 см3 питательного бульона 10-кратной концентрации (готовят путём увеличения в 10 раз навески сухого препарата, указанной на этикетке) и 0,5 см3 смыва (или 1 см3 4-часовой бульонной культуры) бактерий Е. coli. Дли контроля культуры 0,1 см3 смыва бактерий (или 0,2 см3 4-часовой бульонной культуры) Е. coli помешают в чашку Петри и заливают ни питательным агаром. Посевы переносят в термостат и выдерживают при температуре 37 °С в течение 18 ч.
После инкубации из объёма 50 см3 отмеряют 10 см3 в пробирку. Во все пробирки (6 объёмов пробы воды по 10 см3) добавляют по 1 см3 хлороформа. Пробирки закрывают стерильными резиновыми пробками, встряхивают для равномерного распределения хлороформа по объёму воды и оставляют на 15 мин при комнатной температуре (Е. coli погибают, остаются только коли-фаги). В 100 см3 расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара добавляют 1 см3 смыва суточной агаровой культуры Е. coli (в концентрации 109/см2 смыва) или 2 см3 4-часовой бульонной культуры Е. coli. Приготовленную смесь разливают в чашки Петри: одну чашку для контроля культуры Е. coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. После застывания агара чашки, предназначенные для посева пробы, делят на 6 секторов, маркируют каждый сектор в соответствии с исследуемыми объёмами и на каждый сектор наносят пастеровской пипеткой по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа) из 6 пробирок с пробой. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при температуре 37 °С на 18 ч. Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете. Учитывают зоны лизиса в виде отдельного пятна или отдельной бляшки. Пробу считают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице НВЧ БОЕ. В протоколе анализа указывают НВЧ коли-фагов в 100 см3 воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ коли-фагов в 100 см3. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считают недействительным.
Контрольные вопросы По каким показателям определяется безопасность питьевой воды в эпидемическом отношении? Какие санитарно-показательные микроорганизмы используют для оценки качества питьевой воды? Какие микробиологические показатели определяют при оценке качества питьевой воды централизованного водоснабжения? Как определяют ОМЧ воды? Что такое ОКБ? Что такое ТКБ? Каким способом подтверждают наличие ОКБ в пробе воды? Как определяют ТКБ воды? В чем сущность метода мембранных фильтров при определении ОКБ и ТКБ воды? Какие фильтры используют при исследовании воды? Как осуществляется постановка оксидазного теста? Как определяется ферментация лактозы? Какой состав жидкой ЛПС? Как проводят определение спор сульфитредуцирующих клостридий при оценке качества питьевой воды централизованного водоснабжения? В чем заключается метод определения коли-фагов? Какой состав железо-сульфитного агара? Какие основные правила отбора проб воды? В течение какого промежутка времени проба питьевой воды должна быть доставлена на анализ? Для каких возбудителей инфекционных заболеваний вода может служить фактором передачи? Назовите с эпидемиологической точки зрения наиболее опасные для человека вирусы, загрязняющие водоемы? Назовите единицы измерения, в которых выражают количество коли-фагов в воде? Какие методы обнаружения микроорганизмов в воде вы знаете?
Что такое гомогенизация и десорбция?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ №2 1. Правила отбора проб воды: 1. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием. 2. Для нейтрализации присутствующих в воде хлорсодержащих дезинфектантов в ёмкость (до стерилизации) вносят серноватисто-кислый натрий из расчёта 10 мг на каждые 0,5 объёма исследуемой воды. Если вода гиперхлорированная, то количество нейтрализатора увеличивают: при концентрации остаточного хлора 2 мг/л добавляют 20 мг нейтрализатора, 3 мг/л - 30 мг и так далее. 3. Стерильную емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. 4. При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. 5. При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании. После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком. 6. Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора, фамилии специалиста, отбиравшего пробу, и другой информации. 2. Хранение и транспортирование проб воды 1. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре (4-10) °С. 2. В холодный период года контейнеры должны быть снабжены термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб от промерзания. При соблюдении указанных условий срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч. 3. Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора.
4. Если не может быть соблюдено время доставки пробы и температура хранения, анализ пробы проводить не следует.
3. Методы обнаружения микроорганизмов в воде. Для обнаружения микроорганизмом в воде и других биосубстратах и определения их количества могут быть использованы бактериологический и микроскопический методы. Основные этапы бактериологического исследования: гомогенизация образца, десорбция микроорганизмов с плотных частиц, приготовление разведений, посев на питательные среды, идентификация выделенных культур. Гомогенизацию образца проводят для равномерного распределения бактерий в анализируемом объекте. При исследовании жидких, плотных, сыпучих продуктов, в зависимости от характеристик испытуемого материала, используют перемешивание простым встряхиванием или специальные приборы. Десорбция бактерий с плотных частиц необходима для анализа объектов твёрдой консистенции. Для этого материал суспензируют в жидкости или с поверхности объекта берут смывы и отпечатки. При суспензировании к навеске образца массой 10 г добавляют 90 см3 воды и интенсивно перемешивают (вручную или в гомогенизаторе). В дальнейшем условно принимают 1 см3 полученной суспензии эквивалентным 0,1 г исходного материала.
4. Термины и определения Общие колиформные бактерии – грамотрицательные, оксидазонегативные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +37 °С в течение 24-48 ч. Термотолерантные колиформные бактерии – входят в состав ОКБ и обладают всеми их признаками, но ферментируют лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре +44 °С в течение 24 ч. Сульфитредуцирующие клостридии - спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия в условиях культивирования на железо-сульфитном агаре при температуре 44 °С в течение 16-18 ч. Коли-фаги – бактериальные вирусы, способные лизировать Е. coli и формировать при температуре 37 °С через 18 ч зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре.
5. Пропись железо-сульфитного агара К 1 л стерильного расплавленного питательного агара добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают количественно во флаконы, автоклавируют при температуре 112 °С в течение 12 мин (основная среда). 20% раствор натрия сульфита (Na2S03) и 8% раствор железа (II) сульфата (FeS04) или железа (II) хлорида (FeCl2) готовят непосредственно перед использованием в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор натрия сульфита нагревают до полного растворения реагента. Перед выполнением анализа в 100 см3 расплавленной основной среды вносят 5 см3 20% раствора натрия сульфита, перемешивают, затем вносят 1 см3 8% раствора железа сульфата, перемешивают и в стерильных условиях разливают в пробирки высоким столбиком по 10-12 см3.
Таблица 1. Санитарно-показательные микроорганизмы в воде централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения
З А Н Я Т И Е 3 Дата ______________ Тема: Санитарно-микробиологическое исследование воды децентрализованного хозяйственно-питьевого водоснабжения.
План занятия 1. Разбор микробиологических показателей, применяемых к питьевой воде источников децентрализованного водоснабжения. 2. Определение бактерий группы кишечных палочек по ГОСТу 18963-73. 2.1. Метод мембранных фильтров. 2.2. Титрационный метод. 3. Определение бактерий группы кишечных палочек по ГОСТу 24849-81.
Методические указания 1. Разбор микробиологических показателей, применяемых к питьевой воде источников децентрализованного водоснабжения В соответствии с СанПиН 2.1.4.1175-02 устанавливаются гигиенические требования к качеству воды, выбору места расположения, оборудованию и содержанию водозаборных сооружений и прилегающей к ним территории. В питьевой воде источников децентрализованного водоснабжения без разводящей сети труб из микробиологических показателей нормируются: - ОМЧ – не более 100 КОЕ/см3 - ОКБ – отсутствие в 100 см3 - ТКБ - отсутствие в 100 см3 - коли-фаги - отсутствие в 10 см3 - исследование на ТКБ и коли-фаги проводят при неблагополучной эпидемиологической обстановке территории. ОМЧ, ОКБ, ТКБ, коли-фаги для воды децентрализованного водопользования определяются по тем же методикам, что и для воды централизованного водопользования. БГКП определяют согласно ГОСТ 18963-73. 2. Определение бактерий группы кишечных палочек по ГОСТу 18963-73 2.1. Метод мембранных фильтров
Этап подготовки и проведения анализа проходит, как при исследовании на ОКБ по МУК 2.1.4.1074-01 (см. выше Занятие №2). На втором этапе идентификации лактозонегативные колонии по ГОСТу 18963-73 (в отличие от МУК 2.1.4.1074-01) отправляют на дальнейшее исследование на способность ферментировать глюкозосодержащую среду до кислоты и газа при температуре 37 °С.
2.2. Титрационный метод Производят посев объёмов пробы воды в ГПС: 100 и 10 см3 пробы – флакон и пробирку со 100 и 10 см3 концентрированной ГПС соответственно, 1 и 0,1 см3 пробы – в пробирки с 10 см3 ГПС нормальной концентрации. Инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 ч. При изменения цвета, образовании газа и помутнении ГПС делают высев на секторы среды Эндо. Дальнейшее исследование проводят, как описано в методе мембранных фильтров. Результаты учитывают по табл. 1.
3. Определение бактерий группы кишечных палочек по ГОСТу 24849-81 Для экстремальных ситуаций и в полевых условиях определённый интерес представляет исследование питьевой воды на БГКП по ГОСТу 24849-81 «Вода питьевая. Полевые методы санитарно-микробиологического анализа». В нём представлена методика исследования воды титрационно-сигнальным методом, как одним из самых доступных вариантов. Пробы воды объёмом 100, 10, 1,0, 0,1 и 0,01 см3 сеют на среду КОДА, которую готовят из готовой сухой смеси. Пробы воды объёмом 100 и 10 см3 вливают во флаконы или пробирки со 100 и 10 см3 концентрированной среды КОДА соответственно (для её приготовления берут удвоенную навеску сухой среды); 1 см3 воды и 0,1 см3 из разбавлений - в пробирке с 10 см3 среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют при температуре 37 °С в течение 48 ч. Предварительный учёт проводят через 24 ч, окончательный – через 48 ч. Положительным результатом теста считают появление мути и изменение цвета индикатора. Коли-индекс (индекс БГКП) вычисляют по табл. 1.
Контрольные вопросы Что называется нецентрализованным водоснабжением? Что служит источниками нецентрализованного водоснабжения? По каким показателям определяется безопасность питьевой воды децентрализованного водоснабжения в эпидемическом отношении? Какие нормативные документы регламентируют исследование воды нецентрализованного водоснабжения? Какие приборы используются для отбора проб воды с глубины? Как определяют ОМЧ воды? Что такое ОКБ? Какие питательные среды используют при определении колиформных бактерий в питьевой воде? Какая среда используется для первичного посева при определении колиформных бактерий в питьевой воде методом мембранных фильтров? Что такое ТКБ? Какой метод оценки качества питьевой воды применяется в полевых условиях? ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ №3
Нецентрализованным водоснабжением является использование для питьевых и хозяйственных нужд населения воды подземных источников, забираемой с помощью различных сооружений и устройств, открытых для общего пользования или находящихся в индивидуальном пользовании, без подачи ее к месту расходования. Источниками нецентрализованного водоснабжения являются подземные воды, захват которых осуществляется путем устройства и специального оборудования водозаборных сооружений (шахтные и трубчатые колодцы, каптажи родников) общего и индивидуального пользования.
Таблица 1. Расчет индекса бактерий группы кишечной палочки
Коли-индекс |
Коли-титр | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 100 | 10 | 1 | 0,1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| - | - | - | - | ≤9 | ≥111 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| - | - | + | - | 9 | 111 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| - | + | - | - | 10 | 105 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| + | - | - | - | 23 | 43 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| + | - | + | - | 94 | 10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| + | + | - | - | 230 | 4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| + | + | - | + | 960 | 1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| + | + | + | - | 2380 | 0,4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| + | + | + | + | ≥2380 | ≥0,4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
З А Н Я Т И Е 4
Дата ______________
Тема: Санитарно-микробиологическое исследование почвы
План занятия:
1. Отбор и предварительная обработка образцов почвы.
2. Определение общего количества бактерий в почве.
3. Определение бактерий группы кишечных палочек.
3.1. Бродильный (титрационный) метод.
3.2. Метод мембранных фильтров
3.3. Прямой поверхностный посев на плотные питательные среды
4. Определение перфрингенс-титра.
4.1. Посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера.
4.2. Использование сред накопления для определения клостридий в почве.
5. Определение термофильных бактерий.
6. Определение нитрифицирующих бактерий
Методические указания
1. Отбор и предварительная обработка образцов почвы
При определении степени загрязнения почвы промышленными источниками места для отбора проб располагают на площади трёхкратной величины санитарно-защитной зоны вдоль вектора розы ветров на расстоянии 100, 200, 300, 1000, 5000 м и более от источника загрязнения (ГОСТ 17.4.4.02-84).
При контроле состояния почв в районе точечных источников загрязнения пробные площадки размером 5x5 м закладывают на разном расстоянии от источника и в относительно чистом месте (контроль). На каждой из выбранных площадок пробы отбирают «по правилу конверта» (четыре пробы по углам участка и одну в центре). В месте отбора пробы выкапывают шурф размером 0,3x0,3 м и глубиной 20 см. Для этой цели используют почвенный бур Некрасова. Поверхность одной из стенок шурфа зачищают стерильным ножом и вырезают из этой стенки почвенный образец массой 200 г, что обычно составляет пласт размером 20x3x3 см.
При определении степени загрязнения почв химическими веществами, пробы отбирают поверхностно (0-1 см) стерильным инструментом (ножом, шпателем) в количестве 0,3-0,5 кг.
При оценке почв сельхоз территорий пробы отбираются два раза в год (весной и осенью) с глубины 0-25 см. На каждые 0-15 га закладывают не менее одной площадки размером 100-200 м2 в зависимости от рельефа местности и условий землепользования. Применяемые для работы инструменты перед взятием каждого нового образца стерилизуют.
Все отобранные образцы собирают в отдельные промаркированные пакеты, изготовленные из специальной бумаги «Крафт» или стерильные емкости, которые после заполнения закрывают пробками с бумагой и немедленно доставляют в лабораторию для анализа. Допускается хранение образцов до начала исследования при температуре 4-5 °С не более 24 ч.
В лаборатории из 5 точечных проб почвы, взятых с одного участка, готовят усреднённую пробу массой около 500 г, тщательно перемешивая и растирая образцы в стерильной фарфоровой чашке резиновым пестиком в течение 5 мин. Посторонние примеси (корни растений, камни, щепки) удаляют путём просеивания почвы через сито, которое предварительно протирают ватным тампоном, смоченным 96% этиловым спиртом.
Из усреднённой пробы отбирают навески (от 1 до 50-55 г в зависимости от определяемых показателей) и готовят суспензию 1:10 на стерильной водопроводной воде (10 г почвы на 90 см3 воды). Для десорбции микроорганизмов с поверхности почвенных частиц приготовленную почвенную суспензию встряхивают в течение 3 мин на мешалке механического диспергатора. После отстаивания суспензии в течение 30с готовят последовательные 10-кратные разведения почвы до концентрации 10-4-10-5 г/см3.
2. Определение общего количества бактерий в почве
Посев проводят в 1,5% МПА – не менее двух различных разведений пробы в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение тщательно перемешивают стерильной пипеткой, забирают 1 см3 суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри. Из каждого разведения посев проводят минимум в две параллельные чашки. После этого в чашки вливают 15-20 см3 предварительно расплавленного и остуженного до температуры 45 °С питательного агара, тщательно перемешивают с почвенной суспензией и оставляют до застывания в строго горизонтальном положении. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат в перевёрнутом виде (крышкой вниз) при температуре 37 °С на 24 ч. После инкубации подсчитывают выросшие колонии и проводят пересчёт на 1 г почвы.
3. Определение бактерий группы кишечных палочек
3.1. Бродильный (титрационный) метод
При анализе почвы с невысокой степенью фекального загрязнения рекомендуют проводить определение БГКП титрационным методом с использованием среды Кесслер или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида (ТТХ). 10 см3 почвенной суспензии первого разведения (1:10) засевают во флакон с 50 см3 среды, что соответствует посеву 1 г почвы. Последующие разведения высевают по 1 см3 в пробирки с 9 см3 той же среды. Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном добавляют 0,3 см3 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон – по 1,5 мл.
Методика посева с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ в трифенилформазан, выпадающий в осадок, придающий среде коричнево-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры подавляется. Посевы на среде Кесслер-Свенертона инкубируют 48 ч при температуре 43 или 37 °С. Отсутствие через 48 ч газообразования и помутнения в бродильных сосудах позволяет дать отрицательное заключение о наличии БГКП. Отрицательное заключение при использовании лактозного бульона с ТТХ дают через 24 ч в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился. При наличии признаков бактериального роста проводят высев на среду Эндо или розоловый агар. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 °С 24 ч. В случае отсутствия признаков роста на чашках дают отрицательное заключение. Красные, розовые с металлическим блеском, жёлтые и оранжевые колонии на розоловой среде типичны для кишечных палочек.
На заключительном этапе исследования проводят идентификацию выросших на агаризованных средах характерных колоний (аналогично анализу БГКП в воде). Результаты анализа выражают коли-титром.
3.2. Метод мембранных фильтров
Данный метод используют в качестве ускоренного метода анализа слабозагрязнённых почв. Через стерильные мембранные фильтры № 3 с помощью фильтровального аппарата Зейтца пропускают 5–10 см3 почвенной суспензии первого разведения, которую предварительно центрифугируют при 2000 об./мин в течение 5 мин. Дальнейшее исследование проводят аналогично анализу БГКП в воде методом мембранных фильтров.
3.3. Прямой поверхностный посев на плотные питательные среды
Этот метод применяют для исследования почвы из мест интенсивного фекального загрязнения. Проводят прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 см3на среды Эндо. При анализе сравнительно чистых почв посев проводят из разведений 1:10-1:100, для загрязнённых почв используют разведение 1:106. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °С в течение 24 ч. На следующем этапе исследования идентифицируют выделенные бактерии (аналогично определению БГКП в воде).
Результаты двух последних методов исследований выражают коли-титром или коли-индексом.
4. Определение перфрингенс-титра
4.1. Посев почвенных разведений в среду Вильсона-Блера
Из всех почвенных разведений (до 1:106) образцы по 1 см3 переносят в 2 параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80 °С в течение 15 мин и/или при 90 °С – 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 9-10 см3 свежеприготовленной среды Вильсона-Блера. Инкубацию посевов проводят при температуре 37 или 43 0С в течение 24 ч. Учёт можно проводить и несколько раньше, так как санитарно-показательные клостридии, преимущественно С. perfringens, через несколько часов образуют колонии чёрного цвета. Обнаружение в мазках колоний характерных грамположительных палочек указывает на наличие С. perfringens. Общепринятая методика определения С. perfringens на среде Вильсона-Блера имеет существенный недостаток – питательная среда в определённой степени ингибирует рост микроорганизма. Для устранения этого явления предложена модификация методики.
4.2. Использование сред накопления для определения
клостридий в почве
По 1 см3 прогретых и нативных почвенных разведений засевают в про - бирки с полужидкими и жидкими питательными средами, предварительно регенерированными кипячением (Клодницкого, Китт-Тароцци, бульона Мартена с ватой и др.). После инкубации посевов в течение 18-20 ч при температуре 37 °С проводят высев 0,5-1 см3 материала из помутневших пробирок в среду Вильсона-Блера или сульфит-полимиксин-неомициновую среду. Посев, инкубацию и учёт при этом проводят аналогично первому способу.
5. Определение термофильных бактерий
Учёт термофильных сапрофитных микроорганизмов производят на МПА, который разливают толстым слоем. Посев проводят из разведений 1:10-1:106 в 2-3 параллельные чашки Петри. Учёт проводят после инкубации в течение 24 ч при температуре 60 °С аналогично, как при определении общего количества бактерий в почве.
6. Определение нитрифицирующих бактерий
Для определения нитрифицирующих бактерий сеют почвенные разведения во флаконы с минеральной средой Виноградского, разлитой тонким слоем. В ходе эксперимента два флакона со средой оставляют незасеянными в качестве контроля чистоты среды. Посевы инкубируют при температуре 28 °С в течение 14-15 сут. При развитии нитрифицирующих бактерий в среде образуются азотистая и азотная кислоты, которые определяют на 5-7 сутки после посева и вторично – на 14-15. Титр нитрифицирующих бактерий определяют качественной реакцией с дифениламином, который в присутствии азотистой и азотной кислот даёт синее окрашивание. Пастеровской пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносят на стеклянную или фарфоровую пластинку, добавляют несколько капель дефениламина, разведённого концентрированной серной кислоте. Синее окрашивание указывает на присутствие в среде продуктов метаболизма нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов должна оставаться без изменения окраски.
Заключение _________________________________________________
Контрольные вопросы
Как отбирают образцы почвы для исследований?
Как формируется усредненная проба образцов почвы?
Как определяется ОКБ в почве?
Какие методы используются для определения БГКП в почве?
В чем сущность бродильного метода определения БГКП?
В каких случаях используется прямой поверхностный посев почвы на плотные питательные среды?
Что такое перфрингенс-титр?
Какими методами определяется перфрингенс-титр?
Какие питательные среды используют для определения перфрингенс-титра?
Какие среды накопления используют для определения клостридий в почве?
Какие микроорганизмы называют термофильными?
Каким образом определяют термофильные бактерии в почве?
Какую питательную среду используют для определения нитрифицирующих бактерий?
Какие СПМО почвы вы знаете?
Какие микроорганизмы попадают в почву с выделениями человека и животных и дольше всех в ней сохраняются?
Какие показатели определяют при санитарном анализе почвы?
Какую роль в почве выполняют аммонификаторы и нитрификаторы?
ПРИЛОЖЕНИЕ К ЗАНЯТИЮ №4
При выборе объектов в первую очередь обследуют почвы территорий, наиболее значимых для здоровья населения. При проведении текущего санитарного надзора за состоянием почвы ограничиваются кратким санитарно-микробиологическим анализом, указывающим на наличие и степень фекального загрязнения, а также характеризуют процессы самоочищения почвы от загрязнителей органической природы и энтеробактерий.
Полный санитарно-микробиологический анализ почвы проводят в форме предупредительного санитарного надзора. Для изучения воздействия химических поллютантов на биогеоценоз необходимо исследование их бактерицидного действия на почвенную микробиоту, заключающегося в изменении состава сообщества почвенных микроорганизмов и ферментативной активности почвы. По эпидемическим показаниям проводят индикацию патогенной микробиоты.
1. Результаты исследования почвы используют для:
· определения степени опасности для здоровья людей в населённых пунктах (по эпидемиологическим показаниям);
· профилактики инфекционных и неинфекционных заболеваний (предупредительный санитарный надзор);
· текущего санитарного контроля за объектами, прямо или косвенно воздействующими на окружающую среду.
2. Санитарно-показательные микроорганизмы, характеризующие
загрязнение почвы
Общее количество бактерий - количество микроорганизмов, образующих колонии на МПА при температуре 37 °С в течение 24 ч, - суммарный показатель микробиологического загрязнения почвы микрофлорой преимущественно фекального происхождения.
Термофильные микроорганизмы - микроорганизмы, образующие колонии на МПА при температуре 60 °С в течение 24 ч, - показатель загрязнения почвы компостом или навозом. Почвы, показывающие высокое содержание кишечных палочек и низкое - термофилов, считают фекально загрязнёнными.
БГКП - грамотрицательные не образующие спор короткие палочки, ферментирующие лактозу и глюкозу до кислоты и газа при температуре 37°С в течение 24-48 ч, не обладающие оксидазной активностью.
Перфрингенс-титр - титр грамположительных облигатно-анаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие Clostridium perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.
Аммонификаторы - микроорганизмы, превращающие азот в катионы аммония. Аммонификация (гниение) белков - результат деятельности гнилостной микробиоты (актиномицеты, грибы, анаэробные бациллы). Высокое содержание в почве этой микробиоты свидетельствует о присутствии органических веществ.
Нитрификаторы - микроорганизмы, окисляющие азот из солей аммония в нитраты и нитриты. К этой группе относятся представители родов Nitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrosobacter. Их присутствие свидетельствует о наличии органического загрязнения и активно идущих процессах самоочищения.
Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы - почвенная микробиота, использующая целлюлозу в качестве источника углерода. В этой группе велика роль неспоровых бактерий, базидиальных, дрожжеподобных и несовершенных грибов.
Общая численность сапрофитов - количество микроорганизмов образующих колонии на МПА при температуре 28-30 °С в течение 72 ч. Высокая численность сапрофитной микробиоты свидетельствует об органическом загрязнении почвы.
