Определение целлюлазной активности микрофлоры рубца

Принцип метода основан на способности микрофлоры рубца переваривать хлопковую нитку.

Реактивы. 1. 16%-ный раствор глюкозы. Готовится в день исследования.

Оборудование. Термостат, пробирки, натуральная хлопковая нить № 40, стеклянные шарики, пипетки на 1 и 10 мл.

Ход определения. В пробирку помещают 10 мл свежего рубцового содержимого и вносят туда 0,3 мл 16%-ного раствора глюкозы. Один конец хлопковой нитки фиксируют за горлышко пробирки, другой – за стеклянный шарик, который затем опускают на дно. Образец помещают в термостат при температуре 39 ⁰С. Первый контроль проводят через 12 часов. Если переваривания нитки на протяжении 96 часов не наступает, то целлюлазную активность микрофлоры считают сниженной или отрицательной.

Клиническое значение. У клинически здоровых животных целлюлазная активность микрофлоры рубцасоставляет 90±2 часа (Чуб А.В., 2002). Снижение данного показателя отмечается при кетозе, гепатодистрофии; отрицательная активность характерна для смещения сычуга. Источник: 4

 

10. Определение амилазной активности микрофлоры рубца (методом Коравца)

В основе определения амилазной активности микроорганизмов рубца лежит их способность расщеплять крахмал, остаток которого определяется по цветовой реакции с иодом.

Реактивы. 1. 6,25%- ный раствор крахмала: в колбу вносят 6,25 г водорастворимого крахмала и доливают туда 80 мл дистиллированной воды, перемешивают. Для полного растворения крахмала колбу помещают в кипящую водяную баню при постоянном встряхивании. После этого раствор крахмала охлаждают и переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки дистиллированной прокипяченной водой. Раствор необходимо готовить непосредственно перед исследованием;

2. Фосфатный буфер с рН=6,8: 13,3 гNа₂НРО₄ безводного вносят в мерную колбу на 1 литр и доводят до метки дистиллированной водой;

3. 2 н. раствор соляной кислоты: готовят из фиксонала или следующим способом - 61,3 мл соляной кислоты добавляют в мерную колбу объемом 1 литр с уже внесенным туда 0,5 литра дистиллированной воды. Охлаждают и доводят до метки водой.

4. раствор йодо-йодистого калия: в мерную колбу объемом 1 литр вносят 20,0 г калия йодида и 2,0 г кристаллического йода и доводят до метки дистиллированной водой.

Оборудование. Фотоэлектроколориметр, водяная баня, термостат, пробирки, мерные колбы, пипетки на 1, 2 и 10 мл.

Ход определения. В пробирку «А» вносят 1,6 мл 6,25%-ного раствора крахмала и 7,4 мл фосфатного буфера. Содержимое перемешивают и нагревают в течение 10 минут в водяной бане при температуре 40 ⁰С. После этого в пробирку «А» добавляют 1 мл профильтрованного содержимого рубца и тщательно перемешивают.

Далее из пробирки «А» отбирают 0,5 мл жидкости и переносят в мерную колбу на 50 мл с предварительно внесенными туда 2 мл соляной кислоты. Затем в колбу добавляют 2 мл раствора йодо-йодистого калия и доводят до метки дистиллированной водой (проба до инкубации).

После этого пробирку «А» помещают на 1 час в водяную баню при температуре 40 ⁰С, помешивая ее через каждые 10 мин. Затем из пробирки «А» отбирают 0,5 мл жидкости и переносят в мерную колбу на 50 мл с предварительно внесенными туда 2 мл соляной кислоты, приливают 2 мл раствора йодо-йодистого калия и доводят до метки дистиллированной водой (проба после инкубации).

Затем производят определение оптической плотности образцов до и после инкубации в кюветах с длиной оптического пути 5 мм на красном светофильтре (длина волны 620 нм) против дистиллированной воды.

По калибровочной кривой определяют количество крахмала в растворах до инкубации и после. Разница между этими показателями показывает количество мг крахмала, расщепленного микробной амилазой за один час инкубации. Амилазная активность выражается количеством крахмала в мг, который расщепляется 1 мл содержимого рубца за один час. Определяется по формуле: (А-В)×20= мг крахмала, расщепленного 1 мл рубцового содержимого в течение 1 часа инкубации, где А – количество мг крахмала в растворе до инкубации; В - количество мг крахмала в растворе после инкубации; 20 – коэффициент перерасчета на 1 мл содержимого рубца.

Клиническое значение. При содержании в рационе большого количества крахмалосодержащих кормов (дерть ячменная, пшеничная, овсяная, кукурузная и т.д.) происходит повышение амилазной активности содержимого рубца до 89,7±2,67 мг крахмала за час. При дефиците в рационе данного элемента амилазная активность снижалась до 38,2±5,4 (Чуб А.В., 2002). Источник: 4