Реакция с 5-(оксиметил)фурфуролом (реакция Шульце-Распайля)

1. В первую пробирку наливают 1 мл 0.01% раствора триптофана, во вторую – 1 мл 1% раствора белка.

2. В обе пробирки добавляют по 4 капли сахарозы.

3. Затем осторожно по стенке пробирки наслаивают в каждую по 1 мл H₂SO_{4 (конц.)}, следя, чтобы жидкости не перемешивалась.

4. Через некоторое время наблюдают окраску растворов на границе соприкосновения жидкостей.

 

* Качественная реакция на пролин (нингидриновая реакция)

1. В пробирку к 3 мл 0.01% раствора пролина добавляют 5 капель 1% раствора нингидрина в 95% ацетоне.

2. Содержимое пробирки перемешивают и нагревают на водяной бане при 70°С в течение 5 мин.

3. Отмечают появление окраски и ее отличие от типичной окраски нингидриновой реакции.

 

* Качественная реакция на тирозин (реакция Миллона)

1. В пробирку к нескольким кристаллам тирозина добавляют 5 мл 2.5% раствора серной кислоты и перемешивают до полного растворения.

2. Приливают 1 мл реактива Миллона, встряхивают и оставляют при комнатной температуре (для ускорения реакции раствор можно слегка прогреть).

3. Отмечают появление окраски.

 

* Качественная реакция на аргинин (реакция Сакагучи)

1. В пробирку наливают 2 мл 0.01% раствора аргинина, добавляют 2 мл 10% раствора NaOH и 5 капель 0.2% спиртового раствора a-нафтола.

2. Содержимое пробирки хорошо перемешивают, приливают 0.5 мл раствора гипобромита (NaBrO) и вновь перемешивают.

3. Немедленно добавляют 1 мл 40% раствора мочевины (для стабилизации окраски).

4. Отмечают появление окраски.

 

* Качественная ракция на гистидин (реакция Паули)

1. К 1 мл 1% раствора сульфаниловой кислоты в 5% растворе соляной кислоты добавляют 2 мл 0.5% раствора нитрита калия (натрия).

2. Пробирку сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2 мл 0.01% раствора гистидина

3. Затем после перемешивания содержимого пробирки приливают 6 мл 10% раствора карбоната натрия.

4. Отмечают появление окраски.

 

* Качественная реакция на метионин (по Мак-Карти и Салливану)

1. К 5 мл 0.02% раствора метионина прибавляют (при помешивании) сначала 1 мл 14.3М раствора NaOH, а затем 0.3 мл 10% раствора нитропруссида Na.

2. Смесь нагревают в течение 10 мин на водяной бане при температуре 35-40⁰С.

3. Затем смесь охлаждают 2 мин в ледяной воде и добавляют при помешивании 5 мл смеси соляной и фосфорной кислот.

4. Смесь взбалтывают 1 мин и охлаждают водой комнатной температуры в течение 10 мин.

5. Отмечают появление окраски.

 

* Качественная ракция на глицин (реакция Циммермана)

1. К 2 мл 0.01% раствора глицина (рН 8.0) приливают 0.5 мл водного раствора о -фталевого диальдегида.

2. Отмечают появление окраски и выпадение осадка.

 

Качественные реакции на пептиды и белки.

* Биуретовая реакция (обнаружение в молекулах пептидов и белков пептидных связей)

1. В одну пробирку наливают 2 мл 1% раствора белка, в другую 2 мл 0.01% раствора глицина, а в третью – столько же дистиллированной воды,

2. Затем в каждую из них вносят по 2 мл 10% раствора NaOH и хорошо перемешивают.

3. Добавляют по 3 капли 2% раствора CuSO₄. Пробирки встряхивают.

4. Отмечают появление окраски, объясняют различия окрашивания.

 

Оформление работы

 

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретический материал по лабораторной

работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы лабораторной работы.

3. Зарисовать результаты хроматографического разделения аминокислот.

4. Описать результаты выполнения качественных реакций на аминокислоты.

5. Сделать выводы.

 

Методические указания к лабораторному практикуму по курсу

«Общая и экологическая биохимия»

Раздел «Белки»

Лабораторная работа № 2

 

Тема:	Простые белки Физико-химические свойства белков
Цель работы:	- Изучение физико-химических свойств белков: определение изоэлектрических точек казеина и желатина - Овладение методом фракционного разделения белков высаливанием

 

Оборудование и материалы:

· Термостат

· Пипетки стекляные на 1 мл и 5 мл

· Микропипетки автоматические

· Цилиндры мерные на 250 мл и 100 мл

· Колба емкостью 100 мл и 250 мл

· Пробирки стекляные

· Штативы для пробирок

· Бумага фильтровальная

· Индикаторная бумага универсальная

· Сито нейлоновое

· Воронки стекляные для фильтрации

 

 Реактивы:

· Яичный белок

· Буферные растворы, рН 1.0, 3.7, 4.7, 5.7, 9.0

· Гидроксид натрия (NaOH), 10% раствор

· Хлорид натрия (NaCl), крист.

· Хлорид натрия (NaCl), насыщенный раствор

· Сульфат аммония ([NH₄]₂SO₄), крист.

· Сульфат аммония ([NH₄]₂SO₄), насыщенный раствор

· Сульфат магния (MgSO₄), крист.

· Сульфат меди (CuSO₄), 2% раствор

· Ацетат свинца (Pb(CH₃COO)₂), раствор

· Желатин, порошок, 0.5% 1% раствор

· Казеин, раствор

· Уксусная кислота (CH₃COOH), 1% раствор

· Уксусная кислота (CH₃COOH), 10% раствор

· Азотная кислота (HNO₃), конц., 5% раствор

· Серная кислота (H₂SO₄), конц.

· Соляная кислота (HCl), конц.

· Трихлоруксусная кислота (ТХУ), 5% раствор

· Спирт этиловый (C₂H₅OH), 96%

· Ацетон

· Фенол, насыщенный водный раствор

· Формалин

· Пикриновая кислота, насыщенный раствор

· Таннин, 10% раствор

· Гексацианоферриат калия (K₃[Fe (CN)₆]), 5% раствор

· Вода дистиллированная

 

Теоретическая часть

 

Белки

 

Все белки являются высокомолекулярными полипептидами. Условную границу между крупными полипептидами и белками провести сложно. Обычно к белкам относят полипептиды с молекулярной массой, превышающей 8000-10000 дальтон. Белки бывают простыми и сложными. К простым белкам относят макромолекулы, состоящие только из аминокислот. Сложные белки включают неаминокислотные компоненты, такие как гем, производные витаминов, липиды, углеводы, атомы металлов и др.

Простые белки

 

Универсальной системы классификации белков не существует. Имеется лишь несколько общеупотребимых систем классификации, частично перекрывающихся между собой. Здесь мы рассмотрим основные принципы классификации белков, основанные на их растворимости, форме молекул, функциях, физических свойствах и особенностях трехмерной структуры.

 

Растворимость

Классификация белков, основанная на их растворимости, была введена в 1907-1908 годах и используется до сих пор (см. табл. 1).

Таблица 1

Растворимость наиболее известных типов белков

 

Тип белков	Характеристика
Альбумины	Растворимы в воде и солевых растворах. По содержанию отдельных амино- кислот особенностей не имеют.
Глобулины	Слаборастворимы в воде, но хорошо растворимы в солевых растворах. По содержанию отдельных амино-кислот особенностей не имеют.
Протамины	Растворимы в 70-80%-ном этаноле, но не растворимы в воде и в абсолютном этаноле. Богаты аргинином.
Гистоны	Растворимы в солевых растворах. Богаты основными аминокисло-тами.
Склеропротеины	Нерастворимы в воде и солевых растворах. Повышено содержание Gly, Ala, Pro.

 

Строго установленных границ между отдельными классами простых белков не существует. Например, четкое разграничение между альбуминами и глобулинами невозможно, если исходить только из их растворимости в воде и солевых растворах. Поэтому глобулины дополнительно подразделяют на псевдоглобулины, легко растворимые в воде, и эуглобулины, нерастворимые в воде, в отсутствие солей.

 

Форма молекул

Если исходить из оценки соотношения длины осей (продольной и поперечной), можно выделить два больших класса белков. У глобулярных белков это отношение составляет величину, меньшую 10, а в большинстве случаев не превышает 3-4. Такие белки характеризуются компактной укладкой полипептидных цепей. Примером служит инсулин, альбумины и глобулины плазмы крови, многие ферменты. Фибриллярные белки, у которых соотношение длины осей превышает 10, состоят из пучков полипептидных цепей, спирально навитых друг на друга и связанных между собой поперечными ковалентными или водородными связями. Примерами фибриллярных белков служат кератин, миозин, коллаген и фибрин.

 

Функции

Белки также классифицируют в соответствии с их биологическими функциями. В соответствии с этим принципом классификации, белки подраз-деляют на структурные, каталитические и транспортные (см. табл. 2).

 

Таблица 2

Биологические функции белков

 

Функция	Белки
Каталитическая	Ферменты
Сократительная	Актин, миозин
Регуляция работы генов	Гистоны, негистоновые ядерные белки
Гормональная	Инсулин
Защитная	Фибрин, иммуноглобулины, интерферон
Регуляторная	Кальмодулин
Структурная	Коллаген, эластин, кератины
Транспортная	Альбумины (преносят билирубин, жирные кислоты и т.д.), гемоглобин (кислород), липопротеины (различные липиды), транс-феррин (железо)
Энергетическая	Различные белки

 

Группу каталитических белков (ферментов), которая включает большинство различных типов белков, подразделяют на классы в соответствии с типом катализируемой ими реакции.

 

Физические свойства

Для ряда белков существуют специальные системы классификации, позволяющие устанавливать различия в пределах семейств сходных белков. Например, широко используются две и обсуждается третья система номенклатуры липопротеинов плазмы. По одной системе липопротеины классифицируют в соответствии с их поведением в электрическом или гравитационном поле. Так на основе электрофоретической подвижности при рН 8.6 различают a₁-, a₂-, b- и g-липопротеины. Вторая система классификации липопротеинов основана на их плотности в гидратированном состоянии. В этом случае различают хиломикроны, ЛПОНП (липопротеины очень низкой плотности), ЛПНП (липопротеины низкой плотности), ЛПВП (липопротеины высокой плотности), ЛПОВП (липопротеины очень высокой плотности). Возможен и третий тип классификации, основанный на первичной структуре апобелков. В соответствии с этой системой различают шесть классов липопротеинов плазмы крови, характеризующихся присутствием апобелков А, B, C, D, E и F, соответственно. Апобелки можно различать, используя иммунологические критерии.

 

Трехмерная структура

Белки можно разграничивать на основе их трехмерной структуры. Основой для такого принципа классификации белков служит структурное сходство или различие ряда белков, выявляемое, главным образом, с помощью рентгеновской кристаллографии.