Работа 1.3.1 Определение количества эритроцитов в 1 мкл крови.

Нормальное среднее содержание эритроцитов в 1 л крови: у мужчин 4,0-5,0∙10¹²/л; у жен-щин - 3,7-4,7∙10¹²/л. Общее количество эритроцитов, циркулирующих в организме взрослого человека - 25∙10¹² - 30∙10¹². Зрелые эритроциты человека не содержат ядра.

Уменьшение количества эритроцитов имеет место при кровотечениях, гемолитических, железо- и B₁₂ (фолиево)-дефицитной анемиях, лейкозах, метастазах злокачественных но-вообразований, гипо- и апластических процессах, сопровождающихся пониженной эрит-робластической функцией костного мозга, и др.

Увеличение количества эритроцитов выявляют при эритремии и эритроцитозах.

Пробирочный метод. Удобным и достаточно точным является способ разведения крови в пробирках. Для этого в предварительно высушенную чистую пробирку точно отмеривают пипеткой 4 мл разводящей жидкости и осторожно выдувают в нее 0,02 мл капиллярной крови (кровь забирают пипеткой от гемометра Сали). Полученное разведение 1:202 мож-но практически принять равным 1:200. Взвесь тщательно перемешивают и затем запол-няют камеру.

Подсчет в камере Горяева. Обычно пользуются камерой Горяева с двумя сетками, раз-граниченными глубокой поперечной канавкой. Сбоку от сеток находятся стеклянные прямоугольные пластинки, к которым притирают специальные шлифованные покровные стекла. Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов (15 ^. 15).

Большие квадраты, расчерченные вертикально и горизонтально на 16 малых квадратов, чередуются с квадратами, разделенными только вертикальными или горизонтальными линиями, и квадратами чистыми, без линий. Глубина камеры равна 1/10 мм, сторона ма-лого квадрата-1/20 мм; таким образом, объем малого квадрата равен 1/4000 мм. Большие квадраты, состоящие каждый из 16 малых, служат при счете ориентирами.

Перед заполнением камеру и шлифованное покровное стекло моют и сушат. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца (только при этих ус-ловиях соблюдается правильный объем камеры). Каплю разведенной крови вносят пипет-кой под притертое покровное стекло камеры. После заполнения камеру оставляют на 1-2 мин в покое для оседания форменных элементов, затем приступают к подсчету при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения (диафрагма прикрыта и несколько опущен конденсор).

Эритроциты считают в пяти больших квадратах (5x16=80 малым квадратам), располо-женных по диагонали, поскольку распределение клеток в камере может быть неравно-мерным. Для этого под микроскопом ищут левый верхний большой квадрат (разграфлен-ный), подсчитывают количество находящихся в нем эритроцитов, затем по диагонали вниз и направо находят следующий разграфленный квадрат и т.д.

Найденное в каждом квадрате число эритроцитов заносят в протокол опыта.

Во избежание повторного подсчета одних и тех же эритроцитов руководствуются сле-дующим правилом: подсчитывают все эритроциты, находящиеся внутри малого квадрата; на разграничительных линиях подсчитывают их только тогда, когда они большей своей половиной заходят внутрь квадрата. Клетки, пересеченные разграничительной линией пополам, подсчитывают лишь на двух сторонах квадрата - левой и верхней; клетки, выхо-дящие большей своей половиной за пределы разграничительных линий, совсем не счита-ют. Результаты подсчета эритроцитов по каждому из 5 больших квадратов записывают отдельно и суммируют. Для расчета количества эритроцитов в 1 л пользуются следующей формулой:

X= А x 4000x Б

В

где X - количество эритроцитов в 1 л крови; А - сумма эритроцитов, подсчитанных в оп-ределенном количестве малых квадратов; 4000 - множитель, приводящий результат к объему 1 мкл крови, поскольку объем малого квадрата 1/4000 мкл; Б - степень разведения крови (200 раз); В - число малых квадратов, в которых считались эритроциты; 106 - коли-чество микролитров в 1 л.

При подсчете в 5 больших (80 малых) квадратах и при разведении крови в 200 раз форму-ла для определения количества эритроцитов в 1 мкл крови приобретает следующий вид:

X= А x 4000x 200 10⁶

80

Для получения более точного результата производится подсчет в двух сетках и используется для подсчета средний арифметический результат.

РАБОТА 1.3.2 Определение содержания гемоглобина.

Гемоглобин является дыхательным пигментом эритроцитов, составляя до 90% их сухой массы. Гемоглобин - сложный белок, состоящий из собственно белковой части (глобин) и небелковой части - простетической группы (гем), содержащей железо. Важнейшая функ-ция гемоглобина - связывание, перенос и высвобождение кислорода. Кроме этого, гемо-глобин является главным внутриклеточным буфером, поддерживающим оптимальное для метаболизма рН. Содержание гемоглобина в норме-130-180 г/л. Определение количества гемоглобина имеет большое значение и является обязательным компонентом любого ана-лиза крови. Важнейшими методами определения являются колориметрические.

Оснащение: гемометр Сали, 0,1 % раствор НСl, дистиллированная вода, капилляр.

Содержание работы.

Гематиновый метод (метод Сали) основан на превращении гемоглобина при добавлении к крови хлористоводородной кислоты в хлорид гематина коричневого цвета. В учебных це-лях используют гемометр Сали, состоящий из трех пробирок одинакового диаметра.

Одна (средняя) пробирка - пустая, две другие содержат стандартный раствор солянокис-лого гематина определенной окраски. В градуированную пробирку до нижней метки на-ливают 0,1 % раствор хлористоводородной кислоты. В капиллярную пипетку до линейки 0,1 набирают кровь и медленно выпускают ее под слой кислоты. Содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 5-10 мин. Затем полученный раствор хлорида гематина темно-коричневого цвета разведят водой до цвета стандарта, интенсивность окраски ко-торого соответствует идеальной норме - содержанию гемоглобина 166,7 г/л (16,67 г%). Как только цвет исследуемой жидкости полностью сравняется с цветом стандартов в ге-мометре Сали, отмечают, какому делению шкалы градуированной контрольной пробирки соответствует нижний мениск жидкости: это и будет искомое количество гемоглобина. В настоящее время метод считается рутинным, в клиниках применяется редко, так как су-ществуют точные автоматические методы.