Принципы изготовления и контроля инактивированных вирусвакцин.

Инактивированные (убитые, корпускулярные или молекулярные) вакцины – препараты, в качестве действующего начала включающие убитые химическим или физическим способом культуры патогенных вирусов или бактерий (клеточные, вирионные) или же извлечённые из патогенных микробов комплексы антигенов, содержащие в своём составе проективные антигены (субклеточные, субвирионные вакцины).

Изготовление инактивированных вакцин также начинается с выбора производственного штамма вируса (с учетом основных его биологических свойств), культивирования и накопления производственного штамма вируса в чувствительной биологической системе (животные, эмбрионы птиц, культура клеток). Затем вируссодержащий материал подвергают очистке и концентрированию различными методами (низкоскоростное центрифугирование, фильтрование, ультрацентрифугирование и др.). Очистка и концентрирование вирусных агентов — важный этап, так как «убитый вирус» не размножается в организме, и для получения достаточно интенсивного иммунного ответа необходимо вводить значительное количество вирусного материала. Суспензии вируса должны быть очищены от балластных веществ (фрагментов клеточных структур, невирусных белков, липидов и др.), которые дают дополнительную нагрузку на иммунную систему организма и значительно снижают специфичность и напряженность иммунных реакций. Полученная после очистки и концентрации вируссодержащая суспензия подвергается инактивации. В случае особо опасных вирусов инактивация предшествует процессу очистки. При этом необходимо иметь в виду, что балластные вещества препятствуют процессу инактивации.

Важным условием эффективности вакцин является выбор инактиватора и оптимальных условий инактивации, позволяющих полностью лишить вирус инфекционности при максимальном сохранении антигенности.

Для инактивации вирусов используют физические и химические методы.

Из физических методов наиболее распространенными являются γ-лучи, УФ-лучи, воздействие температуры, реже ультразвука, фотодинамическое воздействие некоторых красителей (метиленовая синька, акридиновый оранжевый, толуидин и др.).

В практике создания инактивированных вакцин наиболее широкое применение получили химические инактиваторы, такие, как формальдегид), β-пропиолактон, этиленимины, гидроксиламин и др. Реагенты, которые используют для инактивации вирусов, являются мутагенами, поэтому инактиватор должен либо подвергнуться самораспаду, либо переведен в неактивную форму (нейтрализован), а продукты нейтрализации — остаться безопасными.

После инактивации осуществляют контроль на авирулентность, направленный на выявление оставшихся жизнеспособных вирионов. Степень безопасности инактивированных вакцин неразрывно связана с чувствительностью тест-системы, по которой оценивается полнота инактивации вируса. Для этой цели используют чувствительные культуры клеток животных, в том числе эмбрионов птиц. При этом репродукции вируса быть не должно.

Индивидуальный подход определяется свойствами вируса, особенностями болезни, чувствительностью биологических систем. Так, авирулентность вакцин против ящура определяют на крупном рогатом скоте (это более надежно), на свиньях, лабораторных животных и культуре клеток; вакцину против бешенства — на белых мышах; вакцину против болезни Ауески — на кроликах или в культуре клеток, которую использовали для накопления вируса; вакцину против болезни Ньюкасла — на куриных эмбрионах.

Для повышения иммуногенной активности вакцины в ее состав вводят адъюванты — вещества разнообразной химической природы, неспецифически стимулирующие иммунный ответ к различным антигенам. В качестве адъювантов используют: гидроксид алюминия, аэросил, минеральные масла, ДЭАЭ-декстран, сапонин; кроме того, используют синтезированные вещества. Механизмы действия адьювантов разнообразны и до конца не изучены. Одни из них вызывают воспалительную реакцию, другие способствуют депонированию антигенов и замедляют их гидролиз, третьи способствуют усилению поглощения антигенов макрофагами и антиген-представляющими клетками.

К адъювантам предъявляют следующие требования: они должны быть нетоксичными в используемых дозах, не вызывать побочных реакций в организме, сами не обладать антигенной активностью, должны стимулировать развитие длительного гуморального и клеточного иммунитета.

После добавления адъюванта вакцину контролируют на отсутствие посторонних контаминантов (бактерий, грибов) путем посева на питательные среды. Роста микроорганизмов не должно быть. Затем вакцину фасуют во флаконы и этикетируют. Окончательный контроль вакцины на основные показатели: авирулентность, стерильность, безвредность, допустимую степень реактогенности (на восприимчивых животных), антигенную и иммуногенную активность (на лабораторных и восприимчивых животных) осуществляют государственные контролеры в соответствии с техническими условиями на данный препарат.

Инактивированные вакцины отличаются большей стабильностью свойств, они безопаснее. Их применяют для животных любого возраста и в репродуктивных стадах. Такие вакцины используют преимущественно с профилактической целью в благополучных хозяйствах и угрожаемых зонах.

Однако эти вакцины имеют некоторые недостатки:

1. технология их изготовления гораздо сложнее, что связано с необходимостью получения большого количества вируссодержащего материала, очистки, концентрации антигена, инактивации вирусного генома и включения в состав вакцины адъювантов;

2. необходимо проводить прививки многократно и в значительных дозах;

3. они индуцируют менее напряженный и длительный иммунитет, чем при использовании живых вакцин;

4. применять их возможно только парентерально (минуя пищеварительный тракт);

5. они слабее стимулируют Т-систему иммунитета и местный иммунный ответ, поэтому резистентность слизистых оболочек верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта бывает менее выражена, чем после применения живых вакцин;

6. способны иногда вызывать аллергическое состояние после повторной вакцинации.

Технология производства инактивированных вакцин сложнее, чем живых вакцин, и состоит из следующих этапов:

1. выбор производственного штамма;

2. культивирование вируса в биологической системе;

3. определение концентрации вируса (антигена);

4. инактивация, очистка и концентрация вирусного материала;

5. добавление адъюванта;

6. внутрицеховой контроль;

7. расфасовка, этикетирование;

8. заключительный контроль на стерильность, авирулентность, безвредность, реактогенность, антигенную и иммуногенную активность.

Совершенствование вакцин идет в направлении снижения количества балластных компонентов, снижения реактогенности и повышения иммуногенности препарата.

 

Вопрос 49

Принципы приготовления, контроля и применения гипериммунных сывороток и γ - глобулинов при вирусных заболеваниях.

Гипериммунные или специфические сыворотки, предназначенные для решения указанных задач, представляют собой сыворотки крови животных, систематически иммунизированных бактериальными и вирусными антигенами. Гипериммунные сыворотки содержат антитела, обладающие строго специфическими действиями на бактериальные токсины, патогенные бактерии или вирусы, против которых иммунизировали животных.

 На получение высокоактивных лечебно-профилактических и диагностических сывороток влияют: — качество применяемых антигенов, в частности их чистота, объем и концентрация;
— неспецифические раздражители и адъюванты;
 — индивидуальные особенности животных-продуцентов, в частности их способность к иммунобиологической перестройке при создании у них грундиммунитета, для чего необходим тщательный отбор животных-продуцентов;
 — метод и схемы гипериммунизации;
 — содержание и кормление животных в период их подготовки к эксплуатации.

Антиген. Существует прямая связь между качеством антигена, силой антигенного раздражения и уровнем накопления специфических антител в крови животных. Особенно это положение выражено при получении противовирусных сывороточных препаратов. Для приготовления антигенов должны использоваться штаммы микроорганизмов, обладающие хорошо выраженными антигенными и иммуногенными свойствами. Качество антигенов во многом зависит от их чистоты. Под чистотой понимается неконтаминированность их посторонней микрофлорой, в том числе агентами вирусной природы, а также степень очистки антигенов от балластных белков. К качеству антигена также относится состояние суспензии микробных клеток, ее объем и концентрация.

 Адъюванты. При изготовлении гипериммунных сывороток применяют антигены, специфическое действие которых усилено адъювантными веществами, в качестве которых используют гель гидроокиси алюминия, алюмокалиевые квасцы и другие (см. выше). При этом большое значение имеет качество адъювантов. Под качеством адъювантов понимают их чистоту по отношению к содержанию побочных химических соединений, качество и стойкость образования геля, полноту адсорбции антигенов и т. д.

В практике производства антитоксических сывороток широко используется хлористый кальций, алюмокалиевые квасцы, реже адъюванты типа Фрейда, тапиока. При изготовлении большинства противовирусных гипериммунных сывороток используют антигены без адъювантов, так как такие антигены готовятся из вирусосодержащих суспензий, из тканей куриных эмбрионов, лабораторных животных или клеточных культур. Отбор животных-продуцентов, грундирование животных, применяемых для получения сывороток, завозят из стационарно благополучных по заразным заболеваниям районов. При этом они должны быть клинически здоровыми, средней и выше средней упитанности, свободными от накожных паразитов. Всех завезенных животных выдерживают в карантине 45 суток. За это время их всесторонне обследуют с ежедневным (утром и вечером) двукратным измерением температуры тела и проверяют на пораженность гельминтами и при необходимости дегельминтизируют.

Лошадей исследуют на сап, трихомоноз, бруцеллез, туберкулез, пироплазмидозы и инфекционную анемию;
крупный рогатый скот — на туберкулез, бруцеллез, лептоспироз;
свиней — на туберкулез, бруцеллез;
 овец — на бруцеллез, туберкулез, паратуберкулез и другие инфекционные заболевания согласно требованиям нормативно-технической документации.

При отборе животных-продуцентов надо учитывать их физиологические и иммуннобиологические показатели. При использовании лошадей для получения некоторых гипериммунных сывороток, нормальной сыворотки, сыворотки жеребых кобыл (СЖК) и желудочного сока чаще используют помеси донской и казахской пород в возрасте от 3 до 12 лет. От одного донора массой 450—500 кг за год в среднем получают около 360 л желудочного сока и 4000 овцедоз СЖК. Для получения лечебно-профилактических сывороток против пастереллеза, сибирской язвы, рожи, анаэробных и других инфекций используют волов красностепной, калмыцкой, симментальской, швицкой, астраханской и других пород в возрасте от 3 до 8 лет и массой не менее 350 кг. При получении противорожистой сыворотки используют лошадей, волов, а также свиней крупной белой породы в возрасте 5—6 месяцев и массой не менее 80 кг. Овец, баранов и валухов в возрасте 2—3 лет и массой 30—45 кг используют для получения некоторых диагностических (например, листериозных) и нормальных (например, для приготовления сывороточных сред с целью культивирования лептоспир) сывороток. Принято считать, что успех гипериммунизации в значительной степени зависит от породы и возраста животных. Более высокие титры антител получают при использовании для иммунизации породистых животных в возрасте от 3 до 10 лет. Пол животных не имеет существенного значения. Учитывая, что введение антигенов и периодическое кровопускание приводят к нарушению обмена веществ и анемии, а в ряде случаев и к снижению титров антител, первостепенное внимание нужно уделять вопросам полноценного, сбалансированного кормления животных-продуцентов гипериммунных сывороток. Кормление животных-продуцентов отличается от кормления животных вообще, что связано с особой, вышеозначенной и очень большой физиологической нагрузкой на их организм. Кормление животных — доноров крови и желудочного сока на биопредприятиях осуществляется в соответствии с утвержденными рационами

Вопрос 50