Использование лабораторных животных в вирусологии

Цель занятия: ознакомиться с живыми системами в вирусологии; ознакомиться с лабораторными животными как экспериментальной биологической моделью для изучения вирусов; овладеть методами введения вируссодержащего материала белым мышам; отработать методику вскрытия белых мышей и отбора вторичного патологического материала.

Паразитируя только в чувствительных клетках, вирусы, лишённые белоксинтезирующих и энергообменных систем, не могут, подобно, например, бактериям, размножаться на искусственных питательных средах. Процесс их воспроизводства (репродукции) полностью зависит от метаболизма клеток определённого круга чувствительных организмов, которые в вирусологии называют хозяевами. Исходя из этого, изучать, сохранять, поддерживать, накапливать и т.д. вирусы стало возможным только при наличии определённых чувствительных к ним клеток, совокупность которых принято называть живой системой. Процесс накопления вируса в живой системе называют его культивированием.

Существует четыре вида живых систем: естественно-восприимчивые представители фауны и флоры; лабораторные животные; куриные эмбрионы; культура клеток.

Естественно – восприимчивый объект живой природы – это тот вид млекопитающих, растений или других просто организованных представителей всего живого на планете, в клетках которых вирус паразитирует в естественных условиях. Их принято называть «естественными хозяевами вируса». В настоящее время естественно–восприимчивые живые системы могут использоваться в редких случаях. Например, при проведении дифференциальной диагностики клинически схожих вирусных болезней, поражающих один вид млекопитающих. Примером может служить дифференциальная диагностика классической и африканской чумы свиней. А также, например, для изучения так называемой экологической ниши для определенного вида вируса, т.е. экологической среды, в которой имеются благоприятные условия для циркуляции определенного вида вируса.

В настоящее время в вирусологии используют три вида живых систем, к которым относятся лабораторных животные, куриные эмбрионы и культура клеток.

Лабораторные животные – это животные, специально выращиваемые для проведения на них медицинских, ветеринарных и биологических исследований. Они используются для диагностики некоторых инфекционных заболеваний, моделирования экспериментальных острых и хронических инфекционных процессов, установления вирулентности и токсикогенности различных штаммов вирусов и других патогенов, получения противовирусных вакцин и специфических гипериммунных сывороток крови, а также вирусных антигенов как компонентов диагностических наборов и др.

В научно-исследовательской деятельности лабораторных животных используют для изучения биологических и антигенных свойств вирусов, особенностей патогенеза вирусной болезни на уровне организма и на уровне клетки и др.

Виды лабораторных животных. В настоящее время для экспериментальных исследований используют почти всех представителей животного мира: от простейших до высших человекообразных обезьян. Лабораторные животные подразделяются на основные и дополнительные. К основным видам относят лягушек, мышей, морских свинок, кроликов, крыс, хомяков; к дополнительным – птиц, полевок, лошадей, обезьян, собак, кошк, баранов, ослов.

Чаще всего в вирусологии для проведения лабораторных исследований используют мышей, крыс, кроликов, морских свинок. Они обладают высоким уровнем обмена веществ, высокой интенсивностью роста и развития, малым размером тела, большой плодовитостью, непродолжительным сроком беременности, способностью выкормить свое потомство в короткие сроки. Для исследований используют специально выведенные в лабораторных условиях  генетически однородных животных, полученные путем скрещивания потомства одной родительской пары (линейные или имбридные животные).

Требования к лабораторным животным. Лабораторные животные должны быть здоровыми, чувствительными к определенному вирусу (вид и возраст животного), линейными.

В лабораториях животных содержат в специальных помещениях – вивариях. В них организовано несколько отсеков: для не зараженных или контрольных животных и животных, зараженных вирусом. Перед заражением животных метят, чаще всего красками, устойчивыми к слюне животных.

Техника безопасности при работе с лабораторными животными.      При работе с лабораторными животными возникает потенциальная возможность взаимного инфицирования человека и животного (антропозоонозы), а также перекрестного инфицирования животных. Во избежание этого необходимо строго и неукоснительно соблюдать правила личной безопасности.

1 В учебных аудиториях, где проводятся лабораторные занятия с животными, должны быть подготовлены соответствующие расходные материалы, реактивы, дезинфицирующие растворы.2 Перед началом учебных занятий необходимо ознакомить студентов с планом предстоящей работы и требованиями безопасности и личной гигиены при её выполнении.3 Работу с животными проводят исключительно в специальной одежде (халат, чепчик), резиновых перчатках, маске.4 При чрезмерном беспокойстве и агрессивности животного необходимо прекратить манипуляции до успокоения животного. Возможно применение успокаивающих средств.5 Животных заражают преподаватель с помощником, который фиксирует животное общепринятыми методами, исключающими возможность нанесения ими травм (укусов, царапин и др.).6 Исследуемый материал вводят стерильным шприцем, предварительно подобранным и проверенным на пригодность.7 Обо всех несчастных случаях необходимо сообщать преподавателю, проводившему занятие, или инженеру по охране труда.8 При нанесении животным травмы работающему с ним необходимо остановить возможное кровотечение, продезинфицировать рану и наложить повязку. В случае необходимости обратиться за срочной медицинской помощью. 9 После выполнения работы инструментарий тщательно промывают и помещают в стерилизаторы для последующего обеззараживания. Стол и предметы, соприкасавшиеся с исследуемым материалом, обрабатывают дезинфицирующим раствором. Руки промывают водопроводной водой с мылом. Методы экспериментального заражения лабораторных животных. Введение или инокуляция вируссодержащего материала лабораторным животным называется биологическая проба (биопроба) или пассаж. Существуют различные методы введения вируса. Выбор метода зависит от тропизма вируса, т.е. его способности репродуцироваться в клетках ткани определённого вида. В таблице 2 представлены способы введения вируса в зависимости от его тропизма.

Таблица 2

Группы вирусов по тропизму и способы их введения

лабораторным животным

Группа вирусов	Метод введения	Вид вируса
Дерматропные	накожный (скарификация)	вирус оспы
Эпителиотропные	внутри-, подкожный	вирус ящура
Пневмотропные	интраназальный	вирус ларинготрахеита
Энтеротропные	внутрибрюшинный	вирус диареи КРС
Нейротропные	интрацеребрально	вирус бешенства
Пантропные	внутривенный или внутримы-шечный	вирус чумы плотоядных

 

В некоторых случаях один и тот же вируссодержащий материал вводят животным разными способами. Объём дозы инокулируемого вируса зависит от вида животного и метода введения.

Способы фиксации и техника заражения зависит от вида животного.

Мышей (крыс) удерживают за хвост, давая им возможность уцепиться передними конечностями за неподвижный предмет. Захватывают двумя пальцами кожу на затылке и слегка растягивают животное (рис. I).

Кроликов одной рукой удерживают за кожу спины ближе к лопаткам, а другой – придерживают заднюю часть туловища. Это предотвращает нанесение животным травм, например, царапин.

Морских свинок фиксируют одной рукой за грудь, другой – за задние лапы.

Перед постановкой биопробы место введения материала обрабатывают дезинфицирующим раствором (70°-ый этиловый спирт, 3 % - ый спиртовой раствор йода и т.д.).

Подкожное введение. Кожную складку в области спины приподнимают и в её основание, параллельно поверхности тела, вводят иглу (рис. II). У некоторых животных местом подкожного введения является коленная складка (морская свинка), шея (куры), боковая поверхность грудной клетки (собака) и т.д.

Внутрикожное введение. Данный способ введения чаще используют для кроликов, морских свинок, хомяков (крупные животные). Материал вводят иглой скосом наружу под острым углом на 1-2 миллиметра внутрь кожи в области боковой поверхности туловища или живота до приподнимания слоя кожи в виде бугорка.

Для мелких животных (мыши, крысы) данный метод используют реже, т.к. у них кожа намного тоньше. Материал им вводят в область бугорков на коже плантарной поверхности задних конечностей по направлению от пальцев к голеностопному суставу.

Накожное введение. Дерматропные вирусы втирают в скарифицированную кожу. Сначала на поверхности кожи делают несколько поверхностных царапин иглой до появления капель лимфы. Затем в эту область втирают материал стерильной щёточкой (для накожного введения).

Внутримышечное введение. Материал вводят животным в мышцу бедра (у кур – в большую мышцу груди), направляя иглу перпендикулярно поверхности тела (рис. III)

Внутрибрюшинное введение. Животное фиксируют вертикально, головой вниз, для того, чтобы органы брюшной полости переместились к диафрагме, а игла не травмировала кишечник. При этом конечность животного слегка оттягивают, создавая натяжение кожи и мышц брюшной стенки. Иглу вводят на несколько миллиметров под кожу брюшной стенки, параллельно ей (рис. IV).

Внутривенное введение. Мышам и крысам материал вводят в боковую вену хвоста, предварительно натерев её тампоном, смоченным тёплой водой. Помощник сдавливает корень хвоста одной рукой, а другой фиксирует животное за кожу в области затылка. Освободив вену у корня хвоста, медленно вводят материал иглой скосом наружу под острым углом в нижнюю треть вены по направлению к корню хвоста. Если игла попала в вену, то материал легко поступает из шприца, а сосуд на всём протяжении бледнеет.

Морским свинкам материал вводят также в сердце. Для этого определяют место сердечного толчка, в межрёберный промежуток слева и на 1,0 см выше мечевидного отростка вводят иглу без шприца и, если в игле появляется кровь, присоединяют шприц.

Кроликам материал вводят в краевую вену уха, предварительно удалив шерсть и пережав вену ниже места введения. Направление иглы  должно быть по ходу тока крови к голове.

Птице материал вводят в подкрыльцовую вену.  

Интраназальное введение. Большинство лабораторных животных (за исключением кроликов) при интраназальном введении чихают, и материал рассеивается в окружающую среду. Поэтому вначале животным дают небольшую дозу наркоза, затем голову фиксируют в вертикальном положении и по капле наносят материал на кончик носа (рис. V)/ Животное с вдыхаемым воздухом втягивает его внутрь.

Кроликам материал можно закапать непосредственно в нос по каплям, запрокинув ему голову.

Интрацеребральное введение. Кожу головы животного (например, мыши) захватывают большим и указательным пальцами, оттягивают к затылку и фиксируют. Иглой с ограничителем (без шприца) прокалывают кожу и костную пластину черепной коробку на глубину 1,0-2,0 мм в точке пересечения средней сагиттальной линии и перпендикуляра к ней, проходящем за наружным углом глаза. Присоединяют шприц и вводят материал (рис.VI). 

Белым крысам интрацеребрально материал вводят через трепанационное отверстие; молодым кроликам и морским свинкам – прокалывая кости черепа в области надглазничной борозды, где костная ткань наиболее тонкая. Используют иглу с ограничителем, чтобы её проникновение не превышало 3,0-4,0 мм. Старым животным интрацеребрально материал вводят через трепанационное отверстие.

Зараженных животных помещают в клетки или контейнеры с хорошо закрывающимися крышками. На них прикрепляют этикетки с указанием номера экспертизы, даты заражения, наименования материала и числа зараженных животных. За животными устанавливают ежедневное наблюдение с целью выявления признаков репродукции вируса. При постановке биопробы оставляют контрольную группу животных (не заражённые материалом с вирусом). Признаки репродукции вируса у лабораторных животных. 1 Клинические признаки. При репродукции вируса в чувствительных к нему клетках организма животного происходят  морфологические и функциональные изменения, приводящие к соответствующим отклонениям  в поведении и состоянии животного.  Это и есть клиническими признаками болезни. Появление их после экспериментального заражения считают только косвенным доказательством репродукции вируса. 2 Гибель животного в определённые сроки. Следует отметить, что гибель в первые 24 – 48 часов после заражения является неспецифической и может быть связана с травмой или контаминацией вводимого животному материала посторонней микрофлорой. 3 Патологоанатомические изменения в органах животного возникают в связи с гибелью заражённых вирусом клеток. Если после заражения животные не отличались от контрольной группы, то такую биопробу принято называть «слепым пассажем». Животных после слепого пассажа, подвергают эвтаназии, затем отбирают от них ткани, которые предположительно могли содержать вирус в невысоком инфекционном титре.

Существует несколько методов эвтаназии лабораторных животных – это физические и химические. Физические методы включают оглушение, декапитацию (отделение головы), перелом шейных позвонков и разрушение спинного мозга (рис. VII). Химические методы включают ингаляционные средства (такие как СО, СО₂), летучие обезболивающие средства (галотан, энфлуран и др.), снотворные (барбитураты и др.) и наркотические вещества (эфир). Самый оптимальный метод эвтаназии – это передозировка наркотического вещества.

Из полученного материала готовят суспензию, которую водят второй группе животных того же вида. В этом случае животные получают большую дозу вируса. Однако, и в результате второго пассажа инфекционный титр накопившегося вируса может оказаться не достаточным для появления видимых признаков репродукции вируса. В таком случае и второй пассаж будет считаться «слепым». По тому же принципу делают третий пассаж. В случае появления признаков репродукции вируса, уже третья биопроба будет считаться положительной. Все указанные выше признаки (клиника, гибель, патологоанатомические изменения) могут являться основанием только для индикации (обнаружения) вируса в материале. Полученный от положительной биопробы вируссодержащий материал называется выделенный вирус или вторичный патматериал. А процесс его выделения носит название изоляция вируса. Вскрытие лабораторных животных. Для изучения патологоанатомических изменений и отбора вторичного патматериала заражённых животных вскрывают. Вскрытие проводят сразу после гибели или эвтаназии животного для предупреждения контаминации тканей бактериальной микрофлорой. Трупы мелких животных (мыши, крысы, морские свинки) фиксируют иглами на доске или парафиновом блоке, находящемся в кювете, а более крупных – на специальных вскрывочных столах с приспособлением для фиксации конечностей и головы (рис. VIII). Перед вскрытием кожный покров животного обрабатывают ватным тампоном, смоченным 70 °- ным спиртом, Мелких животных можно полностью опускать в дезинфицирующий раствор.Кожу разрезают ножницами или скальпелем по белой линии от лонной кости до шеи, стараясь не прорезать брюшную стенку, и по направлению к каждой конечности. Тупым путём кожу отделяют от брюшины и фиксируют (рис. IX). Затем вскрывают брюшную полость. Из брюшной полости отбирают кусочки (у мелких животных – орган целиком) паренхиматозных органов (печень, селезёнка, почки), брыжеечные лимфатические узлы (рис. X, XI). При наличии патологоанатомических изменений – и другие органы. Вскрывают грудную полость и отбирают лёгкие, средостенные лимфатические узлы, трахею.Череп вскрывают, закрепив животное в брюшном положении и зафиксировав передние конечности и голову. Срезают кожу вместе с ушами, открывая черепную коробку. Вскрывают черепную коробку, делая разрезы вправо и влево от большого черепного отверстия по направлению к глазницам. Затем разрезают кости черепа между глазницами и удаляют участок черепной коробки. Извлекают мозг животного для дальнейшего исследования (рис. XII, XIII).

Материальное обеспечение: мыши, физиологический раствор, парафиновые столики для вскрытия животных, стерилизаторы со стерильным инструментарием (шприцы, пинцеты анатомические, ножницы), вата, 70 ° этиловый спирт, эфир для наркоза, эксикатор, стерильные ватные тампоны, предметные стёкла, фильтровальная бумага.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация методов: а) введения материала мышам; б) эвтаназии; в) вскрытия мышей; г) отбор вторичного патматериал; д) приготовления мазка – отпечатка.

4 Самостоятельная работа студентов: а) введение материала мышам; б) вскрытие мышей; в) отбор вторичного патматериала; д) приготовление мазка – отпечатка.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 Что такое живая система? Какие виды живых систем используют

в вирусологии?

 2 Что такое биопроба?

3 Что такое «слепой пассаж»?

4 Какие бывают признаки репродукции вируса в организме

лабораторных животных?

5 Для каких целей в вирусологии используют лабораторных животных?

6 Требования, предъявляемые к лабораторным животным.