Методы генетики соматических клеток

С помощью этих методов изучают наследственность и изменчивость соматических клеток, что в значительной мере компенсирует невозможность применения к человеку гибридологического метода.

Культуры соматических клеток человека получают из материала биопсий (периферическая кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбриона, клетки из околоплодной жидкости).

В генетике человека используют следующие четыре метода.

1. Простое культивирование – клетки пригодны для цитогенетических, биохимических, иммунологических и др. исследований.

2. Клонирование – получение потомков одной клетки. Дает возможность проводить в генетически идентичных клетках биохимический анализ наследственно обусловленных процессов.

3. Селекция соматических клеток с помощью искусственных сред используется для отбора мутантных клеток с некоторыми свойствами, отбор гибридных клеток. Метод широко используется для изучения генных мутаций (механизмы, спонтанная и индуцируемая частота).

4. Гибридизация соматических клеток основана на слиянии совместно культивируемых клеток разных типов. При введении в культуру клеток РНК-сод. Вируса Сендай инактивированного при облучении ультрафиолетом – частота гибридизации значительно повышается. Гетерокарионы -2 ядра разных клеток в одной цитоплазме. После митоза образуются две одноядерные клетки – синкарионы – настоящая гибридная клетка, содержащая хромосомы обеих исходных клеток. В дальнейшем происходит постепенное удаление хромосом того организма, клетки которого имеют более медленный темп размножения.

Утрата хромосом носит случайный характер и поэтому среди большого числа гибридов всегда можно найти клетку, сохранившую какую-нибудь одну хромосому человека.

Используя подходящую селективную систему, можно отобрать клетки с определенной ферментативной активностью и локализовать ген этого фермента на конкретной хромосоме.

Метод используется для изучения проблемы сцепления и локализации генов.

Можно изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Метод позволяет широко изучать патогенез наследственных болезней на биохимическом и клеточном уровне.

Конъюгация бактерий.

Конъюга́ция (от лат. conjugatio — соединение) — однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид, бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Открыт в 1946 году Дж. Ледербергом и Э. Тайтемом[1]. Имеет большое значение в природе, поскольку способствует обмену полезными признаками при отсутствии истинного полового процесса. Из всех процессовгоризонтального переноса генов конъюгация позволяет передавать наибольшее количество генетической информации.

Явление конъюгации было открыто и хорошо изучено у кишечной палочки (E. coli). Тем не менее, оно имеет место и у других прокариот. Так, в лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики РАН по руководством профессора А. А. Прозорова впервые было показано существование конъюгативного переноса плазмид и хромосомных генов у основного лабораторного штамма бацилл – Bacillus subtilis 168[2].

Механизм

Для успешного установления контакта двух клеток в клетке-доноре должна присутствовать конъюгативная (половая, трансмиссивная) плазмида.

F-плазмида

Наиболее известной конъюгативной плазмидой является F-плазмида, или F-фактор. F-плазмида является эписомой (плазмидой, которая может существовать в клетке как свободный генетический элемент, так и интегрироваться в клеточный геном путём гомологичной рекомбинации) длиной около 100 тыс. (по другим источникам, 60 тыс.) пар оснований. У неё есть собственная точка начала репликации — oriV и точка разрыва — oriT. F-плазмида, как и все конъюгативные плазмиды, кодирует белки, противодействующие прикреплению пилей других бактерий к клеточной стенке данной. Поэтому клетки, уже содержащие конъюгативную плазмиду в свободном или интегрированном состоянии, на несколько порядков реже выступают в роли реципиентов при конъюгации. Клетку, содержащую F-плазмиду, обозначают F+ и называют мужской, при конъюгации она, как правило, выступает в роли донора. Клетка, лишённая F-плазмиды, при конъюгации является реципиентом генетического материала и называется женской.

Помимо прочей генетической информации, F-плазмида несёт локусы tra и trb, в общей сложности содержащие 33 тыс. пар оснований и включающие около 40 генов. В локус tra входит ген, ответственный за белок пилин, а также регуляторные гены, которые в совокупности отвечают за образование половых пилей на поверхности клетки. В этот локус также входят гены, обеспечивающие притяжение поверхности клетки F+ к клетке F- и инициирующие конъюгацию. Имеются разногласия по поводу того, участвуют ли половые пили в непосредственной передаче ДНК от одной клетки к другой. Вероятнее всего, половые пили служат для удержания конъюгирующих бактерий вместе, однако их функция до конца не установлена.

Кроме того, на половых пилях адсорбируются бактериофаги, специфичные к мужским клеткам. К ним относятся РНК-содержащие фаги: R17, MS2, Qβ, f12, а также фаги с одноцепочечной ДНК: fd, f1, M13.

Несколько белков, кодируемых локусами tra и trb, по-видимому, «открывают» канал между двумя конъюгирующими клетками. Считается также, что фермент traD, локализованный в основании пиля, инициирует слияние участков мембран клеток.

Ход процесса

Схематическое изображение конъюгации у бактерий.
1. Клетка-донор выпускает половой пиль.
2. Пиль прикрепляется к клетке-реципиенту, соединяя две клетки.
3. В мобильной плазмиде происходит однонитевой разрыв, и одна цепь ДНК переходит в клетку-реципиент.
4. Обе клетки достраивают вторую цепь ДНК плазмиды, восстанавливая двуцепочечную кольцевую плазмиду, и образуют половые пили. Теперь обе клетки являются полноценными донорами.

Плазмидой кодируется эндонуклеаза, разрезающая одну из нитей её ДНК в определённой точке (oriT). Эта эндонуклеаза называется релаксазой. Релаксаза может функционировать в одиночку или в комплексе с дюжиной других белков, в совокупности составляющих релаксосому. В случае F-плазмиды релаксаза называется TraI, а релаксосома состоит из белков TraI, TraY, TraM и фактора IHF (англ. integrated host factor).

Затем разрезанная цепь раскручивается и 5'-концом переносится в клетку-реципиент. Выдвигалось предположение, что ДНК передаётся по каналам в половых пилях, но к настоящему времени показано, что перенос идёт через поры в клеточной стенке. В первом сегменте поступающей в клетку реципиента нити ДНК расположены антирестрикционные гены. Эти гены должны транскрибироваться в реципиенте сразу же после своего поступления туда, чтобы обеспечить накопление белков, блокирующих процесс разрушения ДНК рестриктазами. Наконец, переданная цепь замыкается в кольцо и на её основе путём репликации восстанавливается двунитевая структура ДНК плазмиды (подробнее о репликации F-плазмиды см. ниже). Для успешной передачи генетического материала и последующей репликации может потребоваться и второй разрыв. Весь процесс конъюгации длится несколько минут.

Конъюгативная плазмида может встраиваться в хромосому путём гомологичной рекомбинации с участием IS-элементов. Конъюгация при этом идёт по тому же механизу, однако реципиенту передаётся не только плазмида, но и хромосомный материала донора. В этом случае процесс затягивается на часы, часто происходит разрыв передаваемой нити ДНК. Путём искусственного прекращения передачи ДНК в разное время и наблюдения за тем, какие гены были при этом переданы, была получена карта хромосомы кишечной палочки (E. coli) и показано её кольцевое строение.

При выщеплении из хромосомы плазмида может захватывать её фрагмент и переносить его с собой в другую клетку (аналогия с трансдукцией). Данный процесс носит название сексдукции.

Некоторые мелкие плазмиды, называемые мобилизуемыми, могут быть перенесены при конъюгации с помощью аппарата переноса «хелперной» трансмиссивной плазмиды. Для этого они должны содержать последовательности, аналогичные oriT конъюгативной плазмиды и распознаваемые её эндонуклеазами.