Молекулярные вакцины. Анатоксины.

В подобных препаратах Аг служат молекулы метаболитов патогенных микроорганизмов. Наиболее часто в этом качестве выступают молекулы бактериальных экзотоксинов. Анатоксины используют для активной иммунопрофилактики токсинемических инфекций (дифтерии, столбняка, ботулизма, газовой гангрены, стафилококковых инфекций и др.).

 

Цель применения анатоксинов — индукция иммунных реакций, направленных на нейтрализацию токсинов; в результате иммунизации синтезируются нейтрализующие AT (антитоксины). Обычный источник токсинов — промышленно культивируемые естественные штаммы-продуценты (например, возбудители дифтерии, ботулизма, столбняка). Полученные токсины инактивируют термической обработкой либо формалином, в результате чего образуются анатоксины (токсоиды), лишённые токсических свойств, но сохранившие иммуногенность.

 

Анатоксины очищают, концентрируют и для усиления иммуногенных свойств адсорбируют на адъюванте (обычно, гидрооксид алюминия). Адсорбция анатоксинов значительно повышает их иммуногенную активность. С одной стороны, образуется депо препарата в месте его введения с постепенным поступлением в кровоток, с другой — действие адъюванта стимулирует развитие иммунного ответа, в том числе и в регионарных лимфатических узлах. Анатоксины выпускают в форме моно- (дифтерийный, столбнячный, стафилококковый) и ассоциированных (дифтерийно-столбнячный, ботулинический трианатоксин) препаратов.

 

Конъюгированные вакцины

В некоторых случаях для иммунизации применяют конъюгированные вакцины, представляющие собой комплексы бактериальных полисахаридов и токсинов. Подобные комбинации значительно усиливают иммуногенность компонентов вакцин, особенно полисахаридной фракции (например, сочетание Аг Haemophilus influenzae и дифтерийного анатоксина). В этой ситуации последний играет роль носителя, и в ответ на введение Аг полисахаридов формируется пул длительно циркулирующих клеток памяти. Предпринимаются попытки создать смешанные бесклеточные вакцины, включающие анатоксины и некоторые другие факторы патогенности, например адгезины. В настоящее время такие вакцины проходят клинические испытания для профилактики коклюша.

 

 

В большинстве случаев вакцины и анатоксины применяют для создания невосприимчивости к одному возбудителю (так называемые моновалентные вакцины). Путём одномоментной иммунизации возможно и достижение множественной невосприимчивости. Для этого создают ассоциированные (поливалентные) препараты, совмещая Аг нескольких микроорганизмов.

 

Для приготовления ассоциированных вакцин обычно используют убитые микробы или их компоненты. Их применение определяют эпидемическая обоснованность (против детских или раневых инфекций), иммунная совместимость и технологическая возможность комбинирования нескольких Аг. Наиболее известные ассоциированные препараты: адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС-вакцина), тетравакцина (вакцины против брюшного тифа, паратифов А и В, а также столбнячный анатоксин) и АДС-вакцина (дифтерийно-столбнячный анатоксин).

 

Методы вакцинопрофилактики.

 

Вакцинные препараты вводят внутрь, подкожно и внутрикожно, парентерально, интраназально и ингаляционно. Способ введения определяют свойства препарата.

 

• Живые вакцины можно вводить накожно (скарификацией), интраназально или перорально;
• анатоксины вводят подкожно,
• неживые корпускулярные вакцины — парентерально.

При массовых иммунизациях выбирают наиболее экономичный способ, обеспечивающий быстрое и эффективное создание иммунной прослойки (невосприимчивых лиц) в популяции, особенно в эпидемический период. Например, интраназальная вакцинация против гриппа в период перед предполагаемой эпидемией или пандемией позволяет быстро и экономически эффективно создать иммунную прослойку в популяции.

 

По степени необходимости выделяют плановую (обязательную) вакцинацию и вакцинацию по эпидемиологическим показаниям. Первую проводят в соответствии с регламентированным календарём иммунопрофилактики наиболее распространённых или опасных инфекций. Вакцинацию по эпидемиологическим показаниям проводят для срочного создания иммунитета у лиц, подвергающихся риску развития инфекции. Например, у декретированного контингента (персонал инфекционных больниц), при вспышке инфекционного заболевания в населённом пункте или предполагаемой поездке в эндемичные районы (жёлтая лихорадка, гепатит А).

 

Эффективность вакцин.

 

Способность вакцин вызывать состояние невосприимчивости проверяют биологическим (заражая патогенными микробами предварительно иммунизированных лабораторных животных) и эпидемиологическим (отслеживая заболеваемость среди иммунизированных лиц) способами.

 

В первом случае основным показателем является индекс защиты вакцины — частное от деления числа заболевших или погибших неиммунизированных животных на такой же показатель иммунизированных животных. Для эпидемиологической оценки используют аналогично рассчитываемый индекс эффективности вакцины. Высокие значения индексов соответствуют большей эффективности вакцинного препарата.

 

 

По аналогии с лекарственными препаратами, одним из условий эффективной вакцинации является доставка вакцинного материала до иммунокомпетентных клеток, так как он может подвергаться различным ферментативным воздействиям. Для этого в вакцины вносят различные стабилизирующие агенты, но более предпочтительно использование различных носителей, например липосом или моноклональных AT.

 

Применение моноклональных AT ограничивают их свойство перекрёстно реагировать с различными тканевыми Аг макроорганизма. Большие перспективы имеют липосомы — микроскопические пузырьки, стенки которых образованы двойным слоем фосфолипидов. Благодаря этому сходству с биологическими мембранами липосомы не распознаются как чужеродные, не проявляют токсических свойств, легко адсорбируются на клетках, а также длительно сохраняют своё содержимое в крови и различных тканевых жидкостях.

 

При поглощении липосом макрофагами их стенки постепенно растворяются, выделяя заключённые в них Аг в цитоплазму фагоцитов, вызывая более интенсивное развитие иммунных реакций, в сотни и тысячи раз превосходящее эффект от парентерального введения Аг. При этом Аг, фиксированные на мембранах липосом проявляют свойства адъювантов, усиливающих развитие иммунного ответа.

22) Сывороточные иммунные препараты.

 

К сывороточным иммунным препаратам относят иммунные сыворотки и Ig. Эти препараты обеспечивают пассивную невосприимчивость к возбудителям инфекционных болезней. Действующее начало таких препаратов — специфические AT. Другими словами, в организм человека вводят готовые эффекторные молекулы. Поэтому их можно использовать для профилактики и лечения инфекций. Содержание AT в сывороточных иммунных препаратах (активность) выражают в титрах AT.

По механизму действия AT сывороточных препаратов проявляют

• агглютинирующий,
• преципитирующий,
• комплементсвязывающий,
• нейтрализующий и другие эффекты.

Обычно сывороточные препараты вводят парентерально; при этом состояние невосприимчивости развивается быстро, но длится недолго (в пределах 2-6 нед).

Иммунные сыворотки.

 

Иммунные сыворотки получают из крови искусственно иммунизированных животных и людей-доноров (в этих целях используют периферическую, плацентарную и абортную кровь). Для получения высоких титров AT лошадей и кроликов иммунизируют дробным введением соответствующих Аг в больших дозах. Препараты, изготовляемые из крови животных, содержат гетерологичные AT, поэтому человеку такие гетерологичные (чужеродные) сыворотки вводят при соблюдении мер предосторожности. Например, столбнячную антисыворотку (получаемую из крови иммунизированных лошадей) вводят после постановки кожных проб на чувствительность, дробно по Безрёдке на фоне приёма десенсибилизирующих средств.

 

Препараты, изготовляемые из крови иммунизированных доноров, содержат гомологичные AT; гомологичные сыворотки лишены многих побочных эффектов гетерологичных сывороток. Гомологичные сыворотки применяют для профилактики и лечения вирусных гепатитов, кори, столбняка, ботулизма и др. После введения гетерологичных сывороток состояние невосприимчивости длится 2-3 нед, эффект гомологичных AT сохраняется 4-6 нед.

 

Иммуноглобулины

           Иммуноглобулины получают осаждением из сыворотки крови, что освобождает их от балластных компонентов. Затем препараты очищают и концентрируют. Ig применяют для лечения и профилактики кори, клещевого энцефалита, стафилококковых инфекций, столбняка и других инфекций.

 

23-29) РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ

 

В этих реакциях принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента: 1) антиген (агглютиноген);

2) антитело (агглютинин)

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).

 

Ориентировочная реакция агглютинации (РА)

Ориентировочная, или пластинчатая, РА ставится на предметном стекле при комнатной температуре. Для этого пастеровской пипеткой на стекло наносят раздельно каплю сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и контрольную каплю изотонического раствора натрия хлорида. В ту и другую бактериологической петлей вносят колонии или суточную культуру бактерий (каплю диагностикума) и тщательно перемешивают их. Реакции учитывают через несколько минут визуально, иногда с помощью лупы (х5). При положительной РА в капле с сывороткой отмечают появление крупных и мелких хлопьев, при отрицательной - сыворотка остается равномерно мутной.

 

Рис. 2. Ориентировочная реакция агглютинации.

 

 Развернутая реакция агглютинации с целью выявления титра специфических антител у больного.

 

Развернутая РА для серодиагностики ставится в сыворотке больных. Ее разводят и изотоническом растворе натрия хлорида от 1:50 - 1:100 до 1:800 или 1: 1600. Так как в более низких титрах сыворотки могут находиться нормальные агглютинины, имеющиеся у здоровых людей или больных с другим диагнозом (диагностический титр). В качестве антигена в этой реакции используют диагностикумы - заведомо известные взвеси, как правило, убитых бактерий.

 В агглютинационные пробирки предварительно разливают по 1 мл изотонического раствора натрия хлорида. В первую из них доливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:100, и, смешав ее, 1 мл переносят во вторую, из второй - в третью и т.д. В полученные двухкратные разведения сывороток (от 1:100 до 1:1600 и более) вносят по 1-2 капли взвеси бактерий, содержащей 3 млрд микробных тел в 1 мл. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 2 часа, затем сутки выдерживают при комнатной температуре.

 

Учет реакции развернутой агглютинации производят, оценивая последовательно каждую пробирку, начиная с контрольных, при осторожном встряхивании. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. Интенсивность реакции агглютинации отмечают следующими знаками: ++++ - полная агглютинация (хлопья агглютината в абсолютной прозрачной жидкости); +++ - неполная агглютинация (хлопья в слабоопалесцирующей жидкости); ++ - частичная агглютинация (хлопья четко различимы, жидкость слегка мутная); + - слабая, сомнительная агглютинация - жидкость очень мутная, хлопья в ней плохо различимы; — - отсутствие агглютинации (жидкость равномерно мутная).

За титр сыворотки принимают последнее ее разведение, в котором интенсивность агглютинации оценивается не менее чем два плюса (++)

 Рис. 7. Развернутая реакция агглютинации.

 

 

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)

Реакция ставится:

1) для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперстных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается,

2) для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперстным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на инертных частицах (латекс, целлюлоза, полистерол, оксид бария и др. или эритроциты барана, I(0)-группы крови человека)

В реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум), то можно применять для выявления антигенов.

 

Рис. 3. Схема РПГА: эритроциты (1), нагруженные антигеном (3), связываются специфическими антителами (4).

 

 

Постановка. В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят - 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

 

Рис.4. Учет РНГА (РПГА).

 

 Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина.

Возбудитель ботулизма - Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Рис. 3. Постановка и результат РНГА.

 

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - оседают в виде пуговки или колечка.

 

Вывод: В сыворотке больного обнаружен ботулотоксин тип Е.

 

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

 

Рис. 8. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) (схема).

 

Принцип реакции основан на способности АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

 

Типирование вируса проводят в реакции РТГА с набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по отсутствию гемагглютинации. Подтипы вируса типа А с антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и другие могут быть дифференцированы в РТГА с набором гомологичных типоспецифических сывороток

 

Рис. 9. Результаты РТГА при типировании вируса гриппа

Условные обозначения: - торможение гемагглютинации (пуговка); - гемагглютинация (зонтик).

 

Выводы: Исследуемый материал содержит вирус гриппа тип А с антигеном H3N2

 

 

РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ

 

Реакции преципитации (РП) основаны на фенoмене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии Аг с АТ. РП ставят в специальных узких пробирках. В качестве реагентов используют гипериммунные преципитирующие сыворотки с высокими титрами АТ к гомологичным Аг. РП позволяет быстро (в течение нескольких секунд) выявлять незначительные количества Аг (можно выявить антиген в таких малых количествах, которые не обнаруживаются химическим путем). Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси антигена.

Рис. 5. Схемы реакций преципитации в пробирке (А) и агаре (Б).

 

Реакция кольцепреципитации Асколи

Постановка. В узкую пробирку диаметром 0,5 см с неразведенной преципитирующей сывороткой в количестве 0,3-0,5 мл, держа ее в наклонном положении, пастеровской пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем антигена. Пробирку осторожно, чтобы не смешать жидкости, ставят вертикально. При правильном наслоении преципитиногена на сыворотку четко обозначается граница между двумя слоями жидкости. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Учет. Результаты реакции учитывают в зависимости от вида антигена и антител через 5-10 мин, 1-2 ч или через 20-24 ч. В случае положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета.

 

 Рис. 4. Реакция кольцепреципитации.