Биохимическая идентификация бактерий

· Биохимическая идентификация основывается на определении ферментов микроорганизмов. Присутствие ферментов определяют по их спосбности разлагать соответсвующие субстраты, для такой идентификации необходимо 18-24 часа. В последнее время определяют непосредственно сами ферменты, для такой идентификации требуется 4-6 часов.

· Традиционно ферменты микроорганизмо в классифицируются на сахаролитические, протеолитические, липолитические, окислительно-восстановительные ферменты, а также ферменты-токсины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов.

 

Тесты на аминокислоты:

1) Декарбоксилазная активность:

М/о (декарбоксилаза) + а/к(Лизин, Орнитин, Аргинин) à NH2 – CH2 - NH2 + CO2 -- Меняется pH среды, индикатор становиться красным

 

2) Дезаминазная активность:

1. М/о (дезаминаза) + а/к(фенил-аланин) à ФПВК(фенил пировиноградная кислота) + NH3 

2. + FeCl3----(добавляют специально, соединяется с бесцветной ФПВК и образует комплекс зелёного цвета)

 

3) Триптофаназная активность: (индолообразовательная р-ия)

1. М/о (триптофаназа) + а/к(триптофан) à ПВК + Индол + NH3

2. + Реактив Ковача(бензальдегид)(соединяется с ПВК) à соединение красного цвета

 

4) H2S:

1. М/о + а/к(Цистеин,метионин) à H2S

2. + FeSO4 à FeS(осадок чёрного цвета)

5) Желатиназная активность:

М/о (желатиназа) + Желатин(Гель) à Разжижение желатина

 

6) Уреазная активность:

1.

pH Щелочной

pH Кислый

II 0

М/о (уреаза) + NH3- C-NH3(Мочевина) à NH3 + H2CO3

O

 

2. + Фенол-рот(Индикатор) à Красное окрашивание

 

7) Цитратная  активность:

1.

pH Щелочной

pH Кислый

М/о (Цитраза) + Цитрат Na à Na2CO3

 

2. +Бромкризоловый синий(индикатор) à Синее окрашивание в щелочной среде

 

8) β – Галактизидазная активность:(Расщепление лактозы)

1. М/о (β – Галактизидаза) + ОНФГ(ортонитрофенил галактозид) à ОНФ (Жёлтого цвета)+ галактоза

*Если происходит расщепление субстрата, такие бактерии называются лактозопозитивными

pH Щелочной

 9) Расщепление сахаров (среды Гисса):

*Среды Гисса – классическая дифференциально-диагностическая среда, это пробирки которые содержат 3 компонента (в каждой по одному). В каждую уколом засеивается микроорганизм и на 24 часа в термостат

 

pH Кислый

pH Щелочной

1. М/о (Сахаролитическа актив) + Углевод(Сахароза/Глюкоза т.д.) à Кислота + Газ

 

 

2. +Индикатор Андрера/Водно голубой(ВP) à Красный чаще всего

 

 

 

10)Тесты на определение продуктов муравьино-кислого брожения:

Муравьино-кислое брожение (МКБ) – это тип облигатно анаэробного метаболизма, который характерен для факультативно анаэробных бактерий.

1. Глюкоза à ПВК + 4 АТФ, а теперь есть 2 пути:

 

2.2 Смешанный тип МКБ:

2.2.1 ПВК à смесь кислот(молочная, уксусная, муравьиная)

2.2.1.1 + MP à Красное окрашивание («положит»)

2.2.1.2 + VP à б/ц («отрицательная»)

2.3 Ацитоиновый тип МКБ:

2.3.1 ПВК à Ацетоин + бутандиол

2.3.1.1 + MP à Жёлтое окрашивание («отрицательный»)

2.3.1.2 + VP à Красное окрашивание («положительный»)

 

МР – тест на метил-рот

VP – реакция Фогеса-Проскауэра (α-нафтоловый реактив и КОН(40%))

 

Бактерии со смешанным типом МКБ – Энторобактерии(почти все)

Бактерии с ацитоиновым типом МКБ

· Энторобактер!

· Клепсиелла

· Серрация

· Стафилококки

 

Дифференциально – диагностические среды:

 

 

Одной из основных Дифференциально-диагностических сред является среда Гисса (пёстрый ряд) – они необходимы для выявления сахаролитических способностей микроорганизмов.

 

Эти среды рекомендованы для изучения ферментации различных углеводов чистыми культурами микроорганизмов с целью их дифференциации. После добавления углевода(глюкозы, лактозы, сахарозы и т.д), в случае положительной реакции продукты ферментации меняют pH среды и в зависимости о индикатора цвет будет меняться. Например, если среда Гисса содержит индикатор Бромтимоловый синий, то цвет её будет изменяться в зависимости от pH: 7,0 – зелёный, >7,0 – синий, <7,0 – жёлтый.

Также можно заметить разрывы среды или образование пузырьков в среде – это свидетельствует о выявлении газа.

 

 

 

Часто используется

 

Результат:

Среда ЭНДО

 

 

Среда Клиглера(Глюкоза + Лактоза) Подробнее в след семаке

Дополнительные тесты

 

Но всё это «крайне» не удобно, так как нужно в день индицировать множество бактерий и микроорганизмов, поэтому были придуманы Тест-системы для быстрой идентификации бактерий.

Как видно Тест-системы представляют собой батареи «микропробирок», которые заполнены различными средами, содержащими белки или углеводы, расщепление которых мы хотим посмотреть.

Распространённые Тест- системы API и РАПИД. Нашего производства хуже по качеству менее чувствительные, но более дешёвые, как всегда в принципе.

API – французская Тест система. Является достаточно большой «семьёй» систем. Прелесть данной системы в том, что она может подключаться к соответствующему анализатору и программа сама оценивает наличие тех или иных микроорганизмов. Расшифровка кода после названия системы:

«20»- значит столько субстратов учувствуют в системе.(на данном примере 10 суб на сахаралит активность и 10 на протеолит активность)

«Е» - идентификации непосредственно энтеробактерий

 

 

Для идентификации стафилококков:

 

И т.д.

Ещё одна система РАПИД – её плюс в том, что она выдаёт результат всего за 4 часа в термостате.

Полученные результаты в той или иной системе оцениваются с помощью таблицы:

Естественно все эти тесты уже оформленны в таблицах для удобства:

Ну, как вы возможно поняли мы идём по градации «крутости» и точности методов идентификации бактерий. Следующей ступенью являются автоматические системы биохимической идентификации.

Здесь всё сводиться просто к выращиванию чистой культуры, а всё остальное делает анализатор непосредственно. То есть микробиолог выращивает культуру и ставит её на обработку биохимического состава. Но биохимическое определение не всегда является точным из-за возможности попадания бактерий другого вида.

В 21 веке, мы отходим от биохомического метода и используем чаще всего геномные исследования, они являются «золотым стандартом среди методов определения бактерий. Поэтому рассмотрим несколько методов изучения генетической информации бактерий для их идентификации:

Рестрикционный анализ – не получил широкого применения, но является прародителем современных генетических методов. Основан на применении ферментов рестриктаз, которые способны разрывать фосфатные связи в ДНК, распознать участок расщепленный рестриктазами и определить его специфичность.

Плазмидная карта

Но гаразно точным и распространнём генетическим методом являетс я Риботипирование.

Это анализ известной 16S рибосомальной ДНК, которая является для всех арганизмов уникальной, как радужка человека или его отпечаток пальца.

Вот что мы получаем

 

И последний метод, совершенно новый и только начинающий применение на практике – масс-спектрия. Состоит из двух компонентов MALDI (матрично-активная лазерная десорбция) и TOF (времяпролётный)

Смысл этого метода состоит в том, что при помощи лазерного луча, происходит «сожжение»части культуры микроарганизмов, а дальше происходит осаждение на специальные матрицы в времяпролётном анализаторе и в зависимости от результатов мы определяем принадлежность микроорганизмов к тому или иному виду.

Этапы:

1. На металической ил пластиковой поверхности культура, полученнная методом Дригальского, смешивается с матречным раствором, формируется кристаллическая структура.

2. После лазер испаряет кристаллы, сжигает его, таким образом ионизирует структуры.

3. И после этого ионизированные структуры во времяпролётном анализаторе определятся до вида.