Cas Pubmed Статьи Стипендиат Google

Абстрактный

Антимикробные пептиды (АМП) играют ключевую роль в врожденном иммунитете, первой линии защиты от бактерий, грибков и вирусов. АМП – это небольшие молекулы, которые варьируются от 10 до 100 аминокислотных остатков, производимых всеми живыми организмами. Из-за их широкого биоразнообразия, насекомые являются одними из самых богатых и инновационных источников для AMPs. В частности, насекомое Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) показывает чрезвычайную способность жить во враждебной среде, так как питается разлагающимися субстратами, которые богаты микробными колониями, и является одним из наиболее перспективных источников для AMPs. Были исследованы личинки и комбинированные взрослые мужские и женские транскриптомы H. illucens, и все последовательности, если можно поставить кодирующие AMPs, были проанализированы с помощью различных алгоритмов машинного обучения, таких как машина поддержки вектора, анализ дискриминантов, Искусственная нейронная сеть и Случайный лес, доступный в базе данных CAMP, чтобы предсказать их противомикробную активность. Кроме того, инструмент iACP, AVPpred и серверы Antifp были использованы для прогнозирования противораковых, противовирусных и противогрибковых препаратов, соответственно. Связанные с этим физикохимические свойства оценивались с помощью калькулятора базы данных антимикробных пептидов и предсказателя. Эти анализы позволили выявить 57 если ставить активные пептиды, пригодные для последующих экспериментальных исследований проверки.

Знакомство

С более чем миллионом описанных видов, насекомые представляют собой самый разнообразный, а также самый большой класс организмов в мире, из-за их способности адаптироваться к повторяющимся изменениям и их устойчивости к широкому спектру патогенов1. Их иммунная система, основанная исключительно на врожденном, хорошо развитом иммунном ответе, позволяет получить общую и быструю реакцию на различные вторгшиеся организмы2^, 3. Гуморальный иммунный ответ включает в себя энзиматический каскад, который регулирует активацию свертывания и меланизации гемолимфы, производство реактивного кислорода (ROS) и азота (RNS) видов, а также производство антимикробных пептидов (AMPs)4.

Сегодня проблема устойчивости к антибиотикам представляет собой одну из самых больших угроз в медицинской сфере4. Постоянная потребность в поиске альтернативных решений со временем повысила интерес к АМП. АМП – это небольшие молекулы, состоящие из 10–100 аминокислот, которые были выявлены во многих организмах, таких как бактерии, грибки, растения, позвоночные и беспозвоночные, включая насекомых5. Это катиотические молекулы, которые проявляют активность против бактерий, грибков, вирусов и паразитов5. В дополнение к этим известным деятельности, многие пептиды также оказывают цитотоксическое действие против раковых клеток6.

Открытие первого AMP, полученного от насекомых, восходит к 1980-м годам, когда Боман и др.7 выявлены и изолированы первые cecropin от lepidopteran Hyalophora cecropia. С тех пор было обнаружено много других AMPs. Из-за их высокого биоразнообразия, насекомые считаются одними из самых богатых и инновационных источников для этих молекул. АМП насекомых можно классифицировать на четыре семьи: α-гелические пептиды (например, цикропины), богатые цистеин пептидами (например, дефенсины), пептиды, богатые глицином, и богатые глицином пептиды8. Несмотря на свое разнообразие, AMPs имеют две общие черты: тенденция к принятию амфипатической конформации и наличие большого количества основных остатков, которые определяют чистый положительный заряд при нейтральном рН9. Установленные электростатические силы между положительными аминокислотными остатками пептида и отрицательными зарядами, выставленными на поверхностях клеток микроорганизмов, позволяют их взаимодействие с бактериальными мембранами. Кроме того, катионная природа этих пептидов позволяет взаимодействовать с отрицательно заряженными молекулами, подвергаемыми воздействию на поверхностях раковых клеток, таких как фосфатилид фосфатилцерин (PS), O-гликозилированные муцины, сиалированные ганглиозиды и сульфат гепарина, в отличие от типичной звиттерионной природы нормальных млокпитаных мембран6^,10^,11. В соответствии с их механизмом действий, AMPs могут быть сгруппированы в две категории12, (1) мембранолитический механизм, описанный тремя различными ативными моделями: "ковер", "тороидальный" и "баррель-став" модель13, и (2) нембранолитический, характеризуется их прямое взаимодействие с внутриклеточных целей, таких как ДНК, РНК и белки14^,15^,16.

На сегодняшний день в базе данных антимикробных пептидов (APD, https://aps.unmc.edu/AP/),которая содержит ровно 3104 АМП из шести царств, было обнаружено и сообщено в базу данных по антимикробным пептидам (APD, https://aps.unmc.edu/AP/), которая содержит ровно 3104 АМП из шести царств: 343 от бактерий, 5 от археев, 8 от протеистов, 20 от грибов, 349 от растений и 2301 от животных. Количество АМП у насекомых варьируется в зависимости от вида, т.е. более 50 AMPs были найдены в инвазивных божья коровка Harmonia axyridis 17, в то время как никто не был идентифицирован в гороховой тле Acyrthosiphon pisum 18. Не-пест насекомое Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae), также известный как Черный солдат Fly (BSF), является одним из наиболее перспективных источников для AMPs возможность жить во враждебной среде, богатой микробных колоний19. В этом исследовании мы проанализировали личинки и комбинированные взрослых мужчин и женщин H. illucens транскриптомы для того, чтобы определить AMPs, которые затем были проанализированы с CAMP (Сборник антимикробных пептидов) базы данных(https://www.camp.bicnirrh.res.in/)20^,21^,22^,23. Кроме того, онлайн-инструмент iACP(https://lin.uestc.edu.cn/server/iACP) был использован для прогнозирования противораковой активности идентифицированных пептидов, в то время как сервер AVPpred(https://crdd.osdd.net/servers/avppred)использовался для прогнозирования противовирусной активности идентифицированных пептидов, в то время какантифектовый сервер (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/antifp) использовался для прогнозирования их противогрибковой активности, а их физико-химические свойства оценивались с помощью антимикробного пептидного калькулятора и предсказателя (APD3).

Результаты

Сборка и идентификация генов De novo transcriptome

Для однозначной идентификации кандидатов на пептид было выполнено секвенирование НОВОГО поколения (RNAseq) РНК, изолированной от личинок и комбинированных взрослых самцов и женщин H. illucens transcriptomes. Секвенирование и сборка транскриптомов de novo привели к выявлению 25 197 уникальных нуклеотидных последовательностей (контигов) в транскриптоме личинок и 78 763 контигов у взрослых. Эти контиги были функционально аннотированы с помощью программного обеспечения Blast2GO(https://www.blast2go.org). В общей сложности 68 генов, кодирующих мАП в транскриптомах H. illucens, были окончательно идентифицированы.

Прогноз противомикробной, противоопухолевой, противовирусной и противогрибковой активности

Все выявленные 68 последовательностей, кодирующих сшатимые AMPs, были проанализированы в силико четырьмя алгоритмами машинного обучения, такими как Support Vector Machine (SVM), Discriminant Analysis (DA), Искусственная нейронная сеть (ANN) и Random Forest (RF), доступные в бесплатной онлайн-базе данных CAMP, чтобы предсказать их антимикробную активность. Результаты показаны в таблице 1. Таблица 2 сообщает противораковые и не противоопухолевой оценки, полученные с помощью инструмента iACP. Таблица 3 показывает результаты, полученные с сервера AVPpred для прогнозирования противовирусной активности и с сервером Antifp, используемым для прогнозирования противогрибковой активности. Эти анализы позволили выявить 57 если не сказать больше активных пептидов: 13 последовательностей, по прогнозам, были только противомикробными, в то время как другие показали различные комбинации противомикробной, противовирусной, противораковой или противогрибковой активности. В частности, 22 из них были как противомикробными препаратами, так и противоопухолевой; восемь из них были как противомикробными, так и противовирусными; два из них были как противомикробными, так и противогрибковые; семь из них были противомикробными, противораковыми и противовирусными; один из них был противомикробным противогрибковые и противовирусные; два из них были противомикробными, противоопухолевой и противогрибковой, в то время как два потенциально охватывают весь спектр анализируемой биологической деятельности (антимикробная, противоопухолявая, противогрибковая и противовирусная). Остальные 11 не проявляют никакой активности в соответствии с расследованием силико. В дополнительной таблице S1 перечислены все прогнозируемые действия.

Таблица 1 Прогнозирование антимикробной активности через базу данных CAMP.

Таблица полного размера

Таблица 2 Прогнозирование противораковой активности с помощью инструмента iACP.

Таблица полного размера

Таблица 3 Результаты, полученные с сервера AVPpred для прогнозирования противовирусной активности и с сервером Antifp для прогнозирования противогрибковой активности.

Таблица полного размера

Физикохимические свойства идентифицированных пептидов

57 выявленных, если ставить активную, пептиды относятся к различным классам АМП, включая дефенсины, ецропины, аттацины и лисозим (рис. 1). Хотя аттацины и лизозим являются белками из-за их высокого молекулярного веса, они принадлежат к классам AMPs из-за их антибактериальной активности. Физикохимические свойства этих пептидов оценивались с помощью калькулятора базы данных антимикробных пептидов и предсказателя APD3 (таблица 4). На рисунке 2 показано графическое представление рассчитанных физико-химических свойств 57 идентифицированных пептидов, в то время как таблица 5 сообщает об их аминокислотном составе и аминокислотной частоте, по сравнению с аминокислотным составом патентных АМП, доступных в базе данных APD. Наибольшее содержание аминокислот во всех проанализированных АМП было обнаружено для остатков Gly, Ala, Arg, Asn, Cys, Leu, Ser, в то время как наименьшее содержание было найдено для его, Met, Trp, Tyr остатков (таблица 5). Графическое представление аминокислотного состава каждого идентифицированного пептида показано в Дополнительном рис. 1. Молекулярная масса идентифицированных пептидов колеблется от 3000 Da для самого маленького пептида Hill_BB_C7985 до 19000 Da для самого большого пептида Hill_BB_C9237, в среднем около 7000 Da. Аминокислотные последовательности варьировались от минимального значения в 31 остаток до максимум 186 остатков и в среднем около 66 остатков. Общее гидрофобное соотношение показало самое низкое значение 26 для пептида NHill_AD_C53857 и самое высокое 60 для пептида Hill_BB_C390, и среднее значение приблизительно 40. Общий чистый заряд идентифицированных пептидов варьировался от 6 евро для пептида Hill_BB_C390 до 9 евро для пептида Hill_BB_C14202 со средним значением 3 евро, в то время как изоэлектрический пункт (ПИ) варьировался от 3,34 для пептида Hill_BB_C390 до 11,83 для пептида NHill_AD_C12928 со средним значением 8,79.

Рисунок 1

Графическое представление идентифицированных классов AMP от личинок и взрослых транскриптомов. На диаграмме пирога показано, что наибольшее количество идентифицированных пептидов относится к классу дефенсинов.

Полное изображение размера

Таблица 4 Прогнозирование физико-химических свойств с использованием калькулятора и предсказателя базы данных антимикробного пептида (APD 3) и инструмента Compute pI / Mw - Expasy.

Таблица полного размера

Figure 2

Графическое представление физикохимических свойств 57 пептидов с мяукательной активностью: (a) общее гидрофобное соотношение; b) общий чистый сбор; c) изоэлектрический пункт; d) молекулярный вес; e) длина пептида; f) Индекс Бомана.

Полное изображение размера

Таблица 5 Аминокислая частота и аминокислотный состав выявленных пептидов.

Таблица полного размера

Рост бактериальных клеток и жизнеспособность

Были отобраны и химически синтезированы четыре противомикробных пептида, а именно Hill_BB_C6571, Hill_BB_C16634, Hill_BB_C46948 и Hill_BB_C7985, которые показали высокие значения противомикробных препаратов со всеми программами прогнозирования. Антимикробная активность этих пептидов была проверена путем мониторинга роста клеток кишечной палочки в присутствии различных концентраций каждого пептида по сравнению с необработанными клетками. Дополнительный рис. 2 показывает кривые роста клеток кишечной палочки в присутствии 3 МКМ (А) или 12 МКМ (В) концентраций каждого пептида. Явное снижение кривых роста наблюдалось в обеих концентрациях по сравнению с необработанными клетками (голубой линией) с бактериями, нарушенными для достижения экспоненциальной фазы на уровне 12 МКМ из-за быстрой смерти. Снижение жизнеспособности клеток наблюдалось с увеличением концентрации каждого пептида по сравнению с необработанными клетками.

Далее, клеточная жизнеспособность кишечной палочки была также оценена путем лечения с 3 МКМ каждого пептида (дополнительный рис. 2C), подтверждающие снижение около 50% в жизнеспособности клеток после 100 мин лечения со всеми четырьмя пептидами проанализированы.

Обсуждения

AMPs являются перспективными кандидатами в качестве альтернативы обычным антибиотикам, благодаря их низкой токсичности для эукариотических клеток и их широкий спектр действий против бактерий, микобактерий, грибков, вирусов и раковых клеток24. AMPs могут убивать бактерии с помощью различных механизмов, включая нарушение мембраны, ориентации внутриклеточных компонентов, или вмешательство в бактериальный метаболизм25^,26^,27. Кроме того, большинство АМП являются катионическими, с положительным чистым зарядом содействия электростатического взаимодействия с отрицательно заряженных бактериальных мембран28.

Все живые организмы производят АМП, а насекомые являются одними из самых богатых источников из-за их высокого биоразнообразия и их чрезвычайно разнообразной среды обитания. Иммунная система насекомого H. illucens очень развита, так как этот вид питается разлагающимися субстратами и навозом, которые чрезвычайно богаты патогенными микроорганизмами, как можно наблюдать и у других видов, таких как в Eristalis tenax. Двадцать два AMPs действительно были определены в Diptera E. tenax, который был в состоянии адаптироваться к различным водным средам обитания (канализационные резервуары и навозные ямы) с тяжелой микробной нагрузкой29. AMPs, которые синтезируются жировым телом и гемоцитами, а затем выделяется в гемолимфе, являются неотъемлемой частью иммунной защиты30^, 31. В этом исследовании мы сосредоточились на уровне генов, чтобы определить все сшативые гены, кодирующие AMPs (рис. 3).

Figure 3

Стратегии, проведенные для выявления пептидов из герметии illucens насекомых.

Полное изображение размера

Были собраны транскриптомы личинок H. illucens, а также объединенных взрослых мужчин и женщин, и все полученные контиги были функционально аннотированы с помощью программного обеспечения Blast2Go, что привело к выявлению 68 мультяшных пептидов, представляющих интерес. Эти последовательности были проанализированы в силико через базу данных CAMP и онлайн-инструмент iACP для оценки их противомикробной и противораковой активности, соответственно. Кроме того, AVPpred и Antifp серверы были использованы для прогнозирования противовирусной и противогрибковой активности, соответственно, выявленных пептидов. Наши результаты привели к выявлению 57 пептидов, 13 из которых были предсказаны как наделенные антимикробной активностью, 22 с противомикробной и противораковой активностью, восемь с противомикробной и противовирусной активностью, два с противомикробной и противогрибковой активностью, семь с противомикробной, противораковой и противовирусной активностью (Дополнительная таблица S1). Только один пептид был предсказан как противомикробная, противовирусная и противогрибковая активность, в то время как два пептида, по прогнозам, имеют предположительно противомикробную, противораковую и противогрибковую активность (Дополнительная таблица S1). Удивительно, но два пептида, соответствующие Hill_LB_C16634 и NHill_AD_C69719 contigs, привели к положительным для всех прогнозов активности (Дополнительная таблица S1). Большинство выявленных пептидов принадлежат к семейств дефенсинов и секробинов, состав которых колеблется от 34 до 51 аминокислоты32^, 33. Эти пептиды имеют узор из шести цистеинов, которые участвуют в формировании трех дисульфидных связей, Cys1-Cys4, Cys2-Cys5 и Cys3-Cys6, для дефенсинов насекомых34. Насекомые дефенсины активны против грам-отрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, но в основном против грамположительных бактерий, таких как золотистый стафилококк, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Aerococcus viridians и Bacillus megaterium. Кроме того, некоторые дефенсины насекомых также активны против грибов35^,36^,37^,38^,39. Например, пептид роялизин, изолированный от маточные желе Apis mellifera, состоит из 51 аминокислоты, а шесть остатков цистеина участвуют в формировании трех дисульфидных связей и активны против грамположительных бактерий и грибков40. Цели дефенсина еще не определены, и исследования отношения структуры и активности могут быть полезны для понимания молекулярного механизма, лежащего в основе их биоактивности41.

Cecropins были впервые очищены от моли H. cecropia и представляют собой наиболее распространенное семейство линейных α-helical AMPs у насекомых, активных как против грам-отрицательных и грамположительных бактерий42. Насекомые цикропины, в основном полученные из лепидоптеранов и дипперанов, являются cecropins A, B и D. Они состоят из 35-37 аминокислот без остатков цистеина и способны озировать бактериальную мембрану и уменьшить поглощение пролина. Например, cecropin B, линейный катионический пептид, состоящий из 35 аминокислот, снижает летальность нагрузки кишечной палочки и уровня эндотоксина плазмы, а также показывает противогрибковую активность против Candida albicans 42^,43. Кроме того, цикропин-как пептид был выделен из слюнных желез самки комара Aedes egypti, показывая противовирусную активность против вируса Денге. Остатки глицина наиболее распространены среди пептидов, которые мы определили, и особенно связаны с белками аттацина44^,45. Хотя механизм действия различных AMPs еще не был полностью выяснен, кажется, что AMPs, в отличие от антибиотиков, имеют больше трудностей в вызывая устойчивость к микробам, и большинство из них не разрушают нормальные клетки высших животных46. Недавно было продемонстрировано, что пептид клаваспирина из туниката Styela clava обладает способностью убивать лекарственно устойчивые патогены, такие как S. aureus, без обнаруживаемой резистентности47. Кроме того, было продемонстрировано, что два пролин богатых пептидов (Lser-PRP2 и Lser-PRP3) не вмешиваться в синтез белка, но оба смогли связать бактериального сопровождающего DnaK и, следовательно, способны ингибировать сворачивание белка48. Характеристики АМП делают их отличными кандидатами на разработку новых препаратов.

Биоинформатический подход представляет собой мощный инструмент для прогнозирования физико-химических свойств и ативной функции аминокислотных последовательностей. Тем не менее, мы стремились выйти за рамки простой функциональной аннотации, которая обычно опирается исключительно на сходство последовательности с пептидами, депонированными в публичных базах данных. Действительно, подход, о котором мы сообщали, основан на использовании нескольких программ, ранее используемых для проведения аналогичного анализа49^,50^,51, которые используют различные алгоритмы для определения оценки, которая предсказывает биологическую активность неизвестных пептидов. Мы продемонстрировали, что аналогичный подход может обеспечить достоверные указания о потенциальной биологической деятельности кандидатов ВПП, что подтверждается нашими предварительными тестами на антимикробную активность четырех выявленных АМП (Дополнительный рис. 2). Тем не менее, исследования проверки были вне сферы этого исследования, которое было по существу направлено на выявление набора пептидов-кандидатов, которые могли бы служить отправной точкой для последующей функциональной характеристики H. illucens AMPs нашей группой, а также другими исследователями в этой области. Действительно, после анализа силико, крупнейшие пептиды могут быть произведены рекомбинантными методологиями, в то время как химический синтез может быть использован для более мелких. Структурный анализ может быть проведен с помощью масс-спектрометрии и кругового дихроизма (CD), а биологическую активность можно оценить с помощью тестов in vitro. Произведенные пептиды, по сути, могут быть протестированы в пробирке для проверки их активности против различных бактериальных штаммов, как грам-отрицательных, так и грамположительных бактерий, линий раковых клеток и грибков. Кроме того, пептиды, показывающие интересную биологическую деятельность, могут быть произведены в слиянии с подходящими тегами для исследования их механизма действия с помощью функциональных экспериментов протеомики и передовых методов масс-спектрометрии, чтобы охарактеризовать их взаимодействие (ы) с целевым белком (главным образом компонентами биологических мембран), таким образом идентифицируя возможные цели белка.

Материалы и методы

Воспитание Герметии illucens и РНК изоляции

Личинки герметии illucens были воспитаны на различных диетах, с тем чтобы свести к минимуму возможное влияние конкретного субстрата на экспрессию пептидов, в соответствии с протоколом, принятым Фогель и др.52. Взрослые были воспитаны в экологической камере в контролируемых условиях: температура 27 ± 1,0 градусов по Цельсию, влажность 70% ± 5%, и фотопериод 12:12 ч.L:D. Поскольку не ясно, выражаются ли все AMPs аналогичным образом в различных личиночино-instars, РНК была получена от двух различных instars, для того, чтобы определить максимальное количество выраженных AMPs. Таким образом, используя РЕагент TRI в соответствии с инструкциями производителя (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), РНК была извлечена из общего тела взрослых и из двух этапов личинки: 2^Nd и 5^Й личинки instar, изолированная РНК которых впоследствии была объединились в соотношении 1:1 для RNAseq. DNase (Turbo DNase, Амбион Остин, штат Техас, США) лечение было проведено для устранения любых загрязняющих ДНК. После удаления фермента DNase, РНК была дополнительно очищена с помощью RNeasy MinElute Clean up Kit (Зиаген, Венло, Нидерланды) в соответствии с протоколом производителя, и элликируется в 20 йл раствора для хранения РНК (Ambion Austin, Texas, США). Целостность РНК была проверена на Agilent 2100 Bioanalyzer с использованием чипов РНК Nano (Agilent Technologies, Пало-Альто, Калифорния), а количество РНК было определено спектрофотометром Nanodrop ND1000.

РНК-Сек, личинки де Ново и комбинированные взрослые мужские и женские транскриптомы сборки и идентификации генов

Секвенирование транскриптома всех образцов РНК было выполнено с помощью поли(А) - обогащенной мРНК, фрагментированной в среднем до 150 нуклеотидов. Секвенирование было проведено Центром генома МаксаПланка (https://mpgc.mpipz.mpg.de/home/)с использованием стандартных процедур TruSeq на секвенсоре Illumina HiSeq2500. Сборка de novo transcriptome была проведена с использованием CLC Genomics Workbench v7.1(https://www.clcbio.com), которая предназначена для сборки больших транскриптомов с использованием последовательностей с короткочитаемых платформ секвенирования. Все полученные последовательности (контиги) использовались в качестве запросов для поиска BLASTX53 в базе данных «Национальный центр биотехнологической информации» (NCBI), не избыточной (nr), учитывая все хиты с E-значением разреза 10^–5. Транскриптомы были аннотированы с помощью BLAST, Gene Ontology и InterProScan поисков с помощью Blast2GO PRO v2.6.1(https://www.blast2go.de)54. Для оптимизации аннотации полученных данных использовался GO slim, подмножество терминов GO, которое обеспечивает более высокий уровень аннотаций и позволяет более глобальное представление о результате. Гены candidate AMP были идентифицированы с помощью установленного эталонного набора AMPs и лизозимов, полученных насекомыми, и дополнительных шагов фильтрации, чтобы избежать интерпретации неполных генов или аликтических вариантов в качестве дальнейших генов AMP52.

В силико-анализе для прогнозирования противомикробной, противораковой, противовирусной и противогрибковой активности

Последовательности, функционально аннотированные как антимикробные пептиды программным обеспечением Blast2Go, были проанализированы с помощью Prop 1.055 и сигнал P 4.056 Серверы для того, чтобы определить пептид сигнала и про-пептидной области. Зрелые и активные пептидные области были проанализированы в силико четырьмя алгоритмами машинного обучения, доступными в базе данных CAMP57: Поддержка вектор машины (SVM), анализ дискриминантов (DA), Искусственная нейронная сеть (ANN), и случайный лес (RF), с тем чтобы предсказать их антимикробной активности. Минимальный рассчитанный порог последовательности для того, чтобы считаться противомикробным, составляет 0,567^,68^,69. Когда все последовательности были проанализированы с помощью алгоритмов, те, с баллом выше 0,5 были автоматически рассмотрены лечения противомикробных препаратов программного обеспечения. Мы хотели бы отметить, что порог внутренне устанавливается программным обеспечением и не может быть изменен пользователем. Это относится к алгоритмам SVM, RF и DA, которые сообщают о результате в численной форме (оценка), в то время как алгоритм ANN предоставляет результаты в качестве категорий, а именно: AMP (антимикробный) или NAMP (не противомикробный). Все последовательности, которые показали положительный результат со всеми четырьмя статистическими методами, рассматривались как противомикробные. Инструмент iACP58^,59^,60^,61^,62 был использован для прогнозирования противораковой активности тех же последовательностей, обеспечивая результаты в численной форме. Предсказание противовирусной активности было выполнено в силико с помощью онлайн-сервера AVPpred. Он использует четыре различные модели: (1) мотив AVP, который возвращает результат как ДА или НЕТ; (2) модель выравнивания, которая дает результат в форме AVP или Non-AVP; (3) Модель композиции и (4) физико-химическая модель, которые возвращают их результаты в численной форме (в процентах). Общий результат выражается с ДА, если результаты пептида имеют ативную противовирусную активность, и с НЕТ, если в противном случае63. Сервер Antifp использовался для прогнозирования противогрибковой активности и обеспечивает результат в качестве численного балла64. Для этого анализа был использован порог 0,5.

Оценка физико-химических свойств

Соответствующие физикохимические свойства выявленных мяукательных активных пептидов после анализа силико, таких как длина пептида, молекулярный вес, общее гидрофобное соотношение, общий чистый заряд, изоэлектрический момент и индекс Бомана, были определены калькулятором и предиктором базы данных антимикробного пептида (APD3)65^,66^,67 и инструмент Compute pI/Mw-Expasy68^, 69.

Рост бактериальных клеток и жизнеспособность

Были отобраны и химически синтезированы четыре противомикробных пептида, а именно Hill_BB_C6571, Hill_BB_C16634, Hill_BB_C46948 и Hill_BB_C7985, которые показали высокие значения противомикробных препаратов со всеми программами прогнозирования и химически синтезированы (Bio-Fab Research, Рим, Италия). Клетки кишечной палочки инкубировались на ночь в среде LB при 37 градусах Цельсия. Затем культура была разбавлена до концентрации 0,08 ОД₆₀₀/mL в свежей среде и выращивается при 37 градусов по Цельсию в течение 90 мин. При значении 0,5 ДЛ антимикробные пептиды были добавлены в культуру при окончательной концентрации 3 или 12 МКМ. Рост культуры оценивался каждые 20 минут в общей сложности 120 мин путем оценки поглощения в 600 нм.

Жизнеспособность клеток оценивалась путем перечисления единиц формирования колонии (CFU) после 16 ч инкубации с 3 МКМ каждого пептида. Серийное разбавление бактериальных культур до концентрации 10^–6 были подготовлены клетки как для обработанных, так и необработанных образцов. Наконец, каждые 20 минут на LB-агаре по 100 л каждого образца покрывалось по 100 л. Плиты инкубировались в течение 16 ч при 37 градусах Цельсия, и затем подсчитывались CFUs, происходящие на каждой пластине. Эксперименты проводились в триликате.

Ссылки

1. 1.

Хиллер, J. F. Насекомые иммунологии и гематопоэзиса. Дев. Комп. Иммунол. 58, 102-118 (2016).

Стипендиат Google

1. 3.

Мармарас, VJ и Lampropoulou, М. Регуляторы и сигнализации в насекомых гемоцитов иммунитета. Сотовый сигнал. 21, 186-195 (2009).

Стипендиат Google

1. 16.

Ди Сомма, А. и др. Антимикробный пептид Temporin L ухудшает деление клеток кишечной палочки, взаимодействуя с Фтсом и дивизомным комплексом. Биохим. Биофизика. Acta Генерал Субдж. 1864, 129606 (2020).

1. 17.

Херардо, Н. М. и др. Иммунитет и другие защитные силы в гороховой тле, acyrthosiphon pisum. ГеномНый биол. 11, R21 (2010).

Стипендиат Google

1. 21.

Мюллер, К.Р., Мика, С., Рётч, Г., Цуда, К. и Шёлькопф, Б. Введение в алгоритмы обучения на основе ядра. IEEE Т. Нейронная Netw. 12, 181-201 (2001).

Статьи Стипендиат Google

1. 22.

Kulkarni, A., Jayaraman, V. K. и Kulkarni, B. D. Поддержка вектор классификации с параметром настройки при содействии агента на основе техники. Вычислить. Chem. Энг. 28, 311-318 (2004).

Статьи Стипендиат Google

1. 26.

Бечингер, Б. и Горр, антимикробные пептиды S. U.: Механизмы действия и резистентности. Д. Дент. Ас. 96, 254-260 (2017).

Статьи Стипендиат Google

1. 35.

Хирш, Р. и др. Профилирование антимикробных пептидов из медицинского личинки Lucilia sericata в качестве потенциальных антибиотиков для MDR Gram-отрицательных бактерий. Д. Антимикроб. Химиотерапия. 74, 96-107 (2019).

Скачать ссылки

Финансирования

Это исследование было поддержано Министерством образования, университетов и исследований Италии (MIUR) в рамках двух проектов (PON R и I 2014-2020, протокол ARS01_00597 и PRIN 2017, протокол Prot. 2017AHTCK7).

Информация об авторе

Принадлежности

1. Факультет наук, Университет Базиликаты, Via dell ' Ateneo Lucano 10, 85100, Потенца, Италия

Антонио Moretta, Розанна Сальвиа, Кармен Scieuzo и Патриция Falabella

1. Кафедра химических наук, Университет Федерико II в Неаполе, Via Cinthia 6, 80126, Наполи, Италия

Анжела Ди Сомма

1. Кафедра энтомологии, Институт химической экологии Макса Планка, Ханс-Кнёлль-Страше 8, 07745, Джена, Германия

Хайко Фогель

1. CEINGE Расширенная биотехнология, Via Gaetano Сальваторе 486, Неаполь, Италия

Пьетро Пуччи

1. Centro di Riferimento Oncologico della Basilicata (IRCCS-CROB), Рионеро в Стервятнике, ПЗ, Италия

Алессандро Сгамбато

1. Кафедра трансляционной медицины и хирургии, Университет Каттолика-дель-Сакро-Куоре, Рим, Италия

Алессандро Сгамбато

1. Институт биопроцессорной инженерии и фармацевтических технологий, Technische Hochschule Mittelhessen, Визенштрассе 14, 35390, Гиссен, Германия

Майкл Вольф

Взносы

Концептуализация, Ф.П.; обработку данных, A.M., R.S. и C.S.; формальный анализ, A.M. и H.V.; методология, A.M., R.S., C.S., H.V., A.D.S. и F.P.; управление проектами, Ф.П.; надзор, Ф.П.; проверка, H.V., P.P., A.S., M.W. и F.P.; написание оригинального проекта, F.P.; рецензирование и редактирование, A.M., R.S., C.S., H.V., P.P., A.S. и M.W.

Автор-корреспондент

Переписка с Патрицией Фалабеллой.

Этические декларации

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствие конкурирующих интересов.

Дополнительная информация

Заметка издателя

Springer Nature остается нейтральной в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и институциональных принадлежностях.

Дополнительная информация

Дополнительная информация.

Права и разрешения

Открытый доступ Эта статья лицензируется в соответствии с Международной лицензией Creative Commons Attribution 4.0, которая позволяет использовать, делиться, адаптировать, дистрибуцию и воспроизведение в любой среде или формате, если вы даете соответствующий кредит первоначальному автору (ы) и источнику, предоставить ссылку на лицензию Creative Commons, и указать, были ли внесены изменения. Изображения или другие материалы третьих лиц в этой статье включены в лицензию Creative Commons статьи, если не указано иное в кредитной линии к материалу. Если материал не включен в лицензию Creative Commons статьи и ваше предполагаемое использование не допускается нормативным регламентом или превышает разрешенное использование, вам необходимо получить разрешение непосредственно от правообладателя. Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Перепечатки и разрешения

Об этой статье

Привести эту статью

Moretta, А., Сальвиа, Р., Scieuzo, C. и др. Биоинформатическое исследование антимикробных пептидов, выявленных в Black Soldier Fly (BSF) Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae). Sci Rep 10, 16875 (2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-74017-9

Скачать цитату

· Получил13 мая 2020 года

· Принято21 сентября 2020 года

· Опубликовано09 октября 2020 года

· Дойhttps://doi.org/10.1038/s41598-020-74017-9

Поделитесь этой статьей

Любой, с кем вы поделитесь следующей ссылкой, сможет прочитать это содержание:

Получить общий ссылку

Предоставлено Springer Nature SharedIt инициативой по обмену контентом

Предметы

· Вычислительная биология и биоинформатика

· Энтомологии

Комментарии

Отправив комментарий, вы соглашаетесь соблюдать наши Условия и Руководящие принципы сообщества. Если вы нашли что-то оскорбительное или не соответствует нашим условиям или руководящим принципам, пожалуйста, пометить его как неуместный.

 

Абстрактный

Антимикробные пептиды (АМП) играют ключевую роль в врожденном иммунитете, первой линии защиты от бактерий, грибков и вирусов. АМП – это небольшие молекулы, которые варьируются от 10 до 100 аминокислотных остатков, производимых всеми живыми организмами. Из-за их широкого биоразнообразия, насекомые являются одними из самых богатых и инновационных источников для AMPs. В частности, насекомое Hermetia illucens (Diptera: Stratiomyidae) показывает чрезвычайную способность жить во враждебной среде, так как питается разлагающимися субстратами, которые богаты микробными колониями, и является одним из наиболее перспективных источников для AMPs. Были исследованы личинки и комбинированные взрослые мужские и женские транскриптомы H. illucens, и все последовательности, если можно поставить кодирующие AMPs, были проанализированы с помощью различных алгоритмов машинного обучения, таких как машина поддержки вектора, анализ дискриминантов, Искусственная нейронная сеть и Случайный лес, доступный в базе данных CAMP, чтобы предсказать их противомикробную активность. Кроме того, инструмент iACP, AVPpred и серверы Antifp были использованы для прогнозирования противораковых, противовирусных и противогрибковых препаратов, соответственно. Связанные с этим физикохимические свойства оценивались с помощью калькулятора базы данных антимикробных пептидов и предсказателя. Эти анализы позволили выявить 57 если ставить активные пептиды, пригодные для последующих экспериментальных исследований проверки.

Знакомство