Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций

Задания для выполнения лабораторной работы

План ЗАНЯТИЯ 1

Микробиологическое исследование гноя при подозрении на стафилококковую или стрептококковую инфекцию. Материал - гной из раны (раневое отделяемое). Для выявления источника стафилококковой внутрибольничной инфекции исследуют материал, взятый тампоном из зева и со слизистой оболочки носа здоровых людей: больничного персонала, а также работников детских учреждений.

1. Бактериоскопическое исследование: приготовить мазки из чистых культур возбудителей гнойных инфекций, а также из гноя и слизистого отделяемого зева. Окрасить их по Граму, микроскопировать и зарисовать. Сделать заключение и наметить план дальнейшего анализа.

2. Ознакомиться с питательными средами, применяемыми при микробиологической диагностике гнойных и раневых инфекций. Указать назначение отдельных питательных сред.

3. Бактериологическое исследование: учесть результаты готовых посевов и мазков из слизистого отделяемого зева на чашки с кровяным агаром:

а) описать колонии и отметить наличие или отсутствие гемолиза;

б) приготовить мазки из колоний, окрасить их по Граму и микроскопировать;

в) пересеять колонию стафилококка в пробирку со скошенным питательным агаром и колонию стрептококка - на скошенный кровяной агар и сахарный бульон для получения соответствующих чистых культур.

План ЗАНЯТИЯ 2

1. Продолжение бактериологического исследования гноя и мазков из зева и носа бактерионосителей:

а) отметить характер роста культуры (наличие золотистого пигмента) в пробирке с питательным агаром. Сделать мазок, окрасить по Граму и микроскопировать;

б) отметить наличие или отсутствие гемолиза на кровяном агаре и помутнение или осадок на сахарном бульоне. Сделать мазок, окрасить по Граму и микроскопировать.

2. В случае выделения золотистого стафилококка:

а) определить его способность продуцировать плазмокоагулазу, лецитиназу;

б) установить фаготипы стафилококков, выделенных из разных источников - больных и бактерионосителей по готовым пробам.

3. Отметить по готовым посевам чувствительность выделенных стафилококков к антибиотикам.

4. Дать краткую характеристику демонстрируемым антимикробным, диагностическим и лечебно-профилактическим препаратам.

Сделать окончательное заключение на основании анализа собственных, демонстрационных и полученных из лаборатории данных о видах выделенных культур стафилококка и стрептококка и об их патогенных свойствах. Определить источник госпитальной инфекции на основании фаготипов, выделенных от больных и носителей стафилококковой инфекции.

 

Методические указания

Материал для исследования: гной, экссудат, раневое отделяемое, перевязочный материал, мазки слизи из носоглотки и зева, кровь - при подозрении на сепсис.

 

Экспресс методы диагностики

Иммунохимические исследования основаны на обнаружении антигенов возбудителя в материале от больного с помощью чувствительных серологических реакций. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР.

Экспресс методы диагностики

Иммунохимические исследования. При отдельных нозологических формах стрептококковой инфекции устанавливают наличие специфических антигенов в крови больного с помощью РСК, реакции преципитации и др.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. При отдельных нозологических формах стрептококковой инфекции устанавливают наличие специфических антигенов в крови больного с помощью РСК или реакции преципитации. Антитела к О-стрептолизину определяют главным образом для подтверждения диагноза ревматизма. Реакция основана на подавлении способности О-стрептолизина растворять эритроциты при наличии в крови больного соответствующих антител. Реакцию ставят со стандартным сухим О-стрептолизином.

 

Экспресс методы диагностики

Иммунохимические исследования. Патогенные штаммы Р. aeruginosa выделяют различные растворимые белковые (экзотоксины и экзоферменты) и небелковые (экстрацеллюлярная слизь) антигены, которые могут быть обнаружены в материале от пациента (из очага, в крови или моче) с помощью чувствительных серологических реакций.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Приготовить мазки из гноя, окрасить их по Граму и микроскопировать. Сделать предварительное заключение и наметить ход дальнейшего анализа.

2. Сделать окончательное заключение о возбудителе или возбудителях раневой инфекции на основании данных, полученных из бактериологической лаборатории.

 

Методические указания

Материал для исследования: гной, раневое отделяемое, отечная жидкость, кусочки мышечной ткани, перевязочный материал, кетгут. Кровь – при сепсисе. При подозрении на столбняк у женщин после родов или аборта - выделения из матки, у новорожденных - выделения из пупка. Рекомендуется брать материал из разных участков очага поражения, особенно из глубоких слоев. Для обеспечения бескислородных условий взятие материала производят шприцем с хорошо притертым поршнем до полного его заполнения и вытеснения воздуха. Затем шприц надевают на иглу, вставленную через резиновую пробку в пробирку со смесью инертных газов (N₂ + Н₂) и СO₂, и вводят в нее исследуемый материал, который изучают в микробиологической лаборатории. Используют также различные специальные транспортные среды, в которые помещают материал, взятый у больных.

 

Задания для выполнения лабораторной работы

План ЗАНЯТИЯ 1

Микробиологическое исследование гноя при подозрении на стафилококковую или стрептококковую инфекцию. Материал - гной из раны (раневое отделяемое). Для выявления источника стафилококковой внутрибольничной инфекции исследуют материал, взятый тампоном из зева и со слизистой оболочки носа здоровых людей: больничного персонала, а также работников детских учреждений.

1. Бактериоскопическое исследование: приготовить мазки из чистых культур возбудителей гнойных инфекций, а также из гноя и слизистого отделяемого зева. Окрасить их по Граму, микроскопировать и зарисовать. Сделать заключение и наметить план дальнейшего анализа.

2. Ознакомиться с питательными средами, применяемыми при микробиологической диагностике гнойных и раневых инфекций. Указать назначение отдельных питательных сред.

3. Бактериологическое исследование: учесть результаты готовых посевов и мазков из слизистого отделяемого зева на чашки с кровяным агаром:

а) описать колонии и отметить наличие или отсутствие гемолиза;

б) приготовить мазки из колоний, окрасить их по Граму и микроскопировать;

в) пересеять колонию стафилококка в пробирку со скошенным питательным агаром и колонию стрептококка - на скошенный кровяной агар и сахарный бульон для получения соответствующих чистых культур.

План ЗАНЯТИЯ 2

1. Продолжение бактериологического исследования гноя и мазков из зева и носа бактерионосителей:

а) отметить характер роста культуры (наличие золотистого пигмента) в пробирке с питательным агаром. Сделать мазок, окрасить по Граму и микроскопировать;

б) отметить наличие или отсутствие гемолиза на кровяном агаре и помутнение или осадок на сахарном бульоне. Сделать мазок, окрасить по Граму и микроскопировать.

2. В случае выделения золотистого стафилококка:

а) определить его способность продуцировать плазмокоагулазу, лецитиназу;

б) установить фаготипы стафилококков, выделенных из разных источников - больных и бактерионосителей по готовым пробам.

3. Отметить по готовым посевам чувствительность выделенных стафилококков к антибиотикам.

4. Дать краткую характеристику демонстрируемым антимикробным, диагностическим и лечебно-профилактическим препаратам.

Сделать окончательное заключение на основании анализа собственных, демонстрационных и полученных из лаборатории данных о видах выделенных культур стафилококка и стрептококка и об их патогенных свойствах. Определить источник госпитальной инфекции на основании фаготипов, выделенных от больных и носителей стафилококковой инфекции.

 

Методические указания

Материал для исследования: гной, экссудат, раневое отделяемое, перевязочный материал, мазки слизи из носоглотки и зева, кровь - при подозрении на сепсис.

 

Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций

Бактериоскопическое исследование (схема 1). Из исследуемого материала (за исключением крови) готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по Граму и микроскопируют. Наличие в препаратах грамположительных гроздевидных кокков, располагающихся в виде скоплений, позволяет поставить предварительный диагноз стафилококковой инфекции.

Бактериологическое исследование. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с кровяным и желточно-солевым агаром (ЖСА) для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток. На следующий день исследуют выросшие колонии на обеих средах. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие гемолиза. На ЖСА S. aureus образует золотистые круглые выпуклые непрозрачные колонии. Вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком. Для окончательного установления вида стафилококка 2 - 3 колонии пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром для получения чистых культур с последующим определением их дифференциальных признаков (табл. 2).

 

Таблица 2. Дифференциальные признаки стафилококков

Признак	Вид
	S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Образование: плазмокоагулазы лецитиназы a-токсина	+ + +	- - -	- - -
Ферментация: глюкозы маннита в анаэробных условиях	+ +	+ -	- +
Чувствительность к новобиоцину	S	S	R

Условные обозначения: (+) - наличие признака; (-) - отсутствие признака; (S) - чувствительный; (R) - резистентный.

 

Постановка реакции на плазмокоагулазу. Разведенную в 2 раза плазму крови разливают по 0,4 мл в пробирки, вносят туда по одной петле каждой исследуемой культуры стафилококка и помещают в термостат при 37 °С. Через 2, 4 и 24 ч отмечают результаты опыта. При наличии плазмокоагулазы образуется сгусток. В некоторых случаях наряду с плазмокоагулазой и лецитиназой определяют фибринолизин, гиалуронидазу, ДНКазу, а также ставят дермонекротическую пробу на кролике.

Для установления источника госпитальной инфекции выделяют чистые культуры стафилококка от больных и бактерионосителей, после чего проводят их фаготипирование с помощью набора типовых стафилофагов. Фаги разводят до титра, указанного на этикетке. Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар в чашку Петри газоном, высушивают, а затем петлей каплю соответствующего фага наносят на квадраты (по числу фагов, входящих в набор), предварительно размеченные карандашом на дне чашки Петри. Посевы инкубируют при 37 °С. Результаты оценивают на следующий день по наличию лизиса культуры. Проводят определение чувствительности стафилококка к антибиотикам.

 

 

Схема 1. Микробиологическое исследование при стафилококковых инфекциях

Экспресс методы диагностики

Иммунохимические исследования основаны на обнаружении антигенов возбудителя в материале от больного с помощью чувствительных серологических реакций. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР.