Кофакторы: факторы свертывания

     Кофакторы - факторы V и VIII свертывания крови, крупные молекулы (Таблица 4, Рис 3), имеющие значительную гомологию структур. Оба белка содержат три разных типа доменов в последовательности А1-А2-В-А3-С1-С2. Три А домена имеют высокую степень гомологии доменам церулоплазмина. Два подобных друг другу С домена (F5/8-C –домены) гомологичны доменам дискоидина. Большой центральный B домен называют связывающей областью, поскольку он локализован между тяжелой цепью, состоящей из двух А доменов и легкой цепью, образуемой одним А доменом и двумя С доменами. Существенные различия между факторами V и VIII обнаружены в структуре связывающей области, которая отщепляется при активации факторов и функционирует как пептид активации.

  Тромбин расщепляет фактор V по остаткам Arg709, Arg1018 и Arg1545. Активированная тромбином форма фактора V- фактор Vа, гетеродимер (А1-А2/А3-С1-С2), состоит из тяжелой и легкой цепей, стабилизированных ионами Са. Фактор Vа – кофактор фактора Xa, активатора протромбина. Участки связывания протромбина, фактора Xa и протеина S, кофактора активированного протеина С (АРС), локализованы в тяжелой цепи фактора Va, а за связывание фосфолипидов мембраны клеток и АРС отвечают участки легкой цепи.

   Фактор VIII секретируется как гетеродимер вследствие расщепления по крайней мере двух связей в В домене. В циркуляции белок стабилизирован фон Виллебранда фактором и имеет время полужизни около 10 часов. Тромбин гидролизует фактор VIII по остаткам Arg372, Arg740 и Arg1689, выщепляя В домен и расщепляя один из высокоаффинных участков связывания фон Виллебранда фактора. Фактор VIII превращается в фактор VIIIа, гетеротример (А1/А2/А3-С1-С2), субъединицы которого стабилизированы ионами Са. Фактор VIIIа – эффективный кофактор фактора IXa, активатора фактора X. Инактивация фактор VIIIа происходит вследствие диссоциации двух А доменов тяжелой цепи или специфического расщепления связи между А1 и А2 доменами активированным протеином С. Фон Виллебранда фактор повышает стабильность фактора VIII и защищает его от инактивации АРС. Контроль активации фактора X является критическим событием гемостаза и тромбоза.

Субстрат свертывания - фибриноген

Фибриноген, составляющий структурную основу тромба, состоит из трех пар неидентичных полипептидных цепей, обозначаемых как Аa, Вb и g(Рис). Молекула фибриногена состоит из трех модулей (доменов), выявленных электронной микроскопией. Аминоконцевые части всех трех цепей образуют центральную область взаимодействия двух субъединиц молекулы фибриногена, ковалентно связанных между собой тремя дисульфидными мостиками, так называемый, Е домен. Карбоксиконцевые (С) участки b и g цепей образуют D домены фибриногена.

 

Фактор XIII - фибринстабилизирующий фактор, существует в двух формах –плазменный и тромбоцитарный. Плазменный фактор XIII- тетрамер, состоящий из двух пар цепей (a и b), а тромбоцитарный содержит только a - цепи.

 

Механизм свертывания крови.

  Разделение механизма свертывания крови на два пути – внутренний (контактная фаза свертывания) и внешний существовало по крайней мере три десятилетия от начала 60-х годов XX века, когда был предложен каскадный механизм реакций образования тромбина.

     

  Контактная фаза свертывания крови.

Контактная активация свертывания крови инициируется in vivo при воспалении, in vitro при контакте плазмы с отрицательно заряженной поверхностью.

 

  На отрицательно заряженной поверхности происходит сборка ассамблеи факторов XII, XI и прекалликреина вместе с кофактором фактора XI и рецептором прекалликреина -высокомолекулярным кининогеном (Рис 5). Связывание фактора XII с отрицательно заряженной поверхностью изменяет конформацию молекулы и делает ее более чувствительной к активации. Фактор XII превращается в активную сериновую протеиназу, фактор XIIa, аутокаталитически или под действием другой протеиназы – калликреина. Активаторами превращения прекалликреина плазмы в калликреин могут служить ряд протеиназ: фактор XIIa (реципроктная активация), матриксные металлопротеиназы (ММР), которые появляются в участке повреждения сосуда и воспаления из предшественников - ПроММР, а также пролилкарбоксипептидаза, фермент инактивирующий ангиотензин II и обеспечивающий взаимодействие калликреиновой и ренин-ангиотензиновой систем. Появившийся калликреин быстро расщепляет неактивный фактор XII в фактор XIIa в реакции положительной обратной связи, которая кинетически более эффективна, чем аутоактивация фактора XII. Калликреин расщепляет высокомолекулярный кининоген (ВМК), освобождая вазоактивный пептид- брадикинин (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg), сильный вазодилататор, который повышает сосудистую проницаемость, стимулирует ноцицептивные рецепторы и вызывает сокращение ряда гладких мышц (например, подвздошной кишки).

      Структурные особенности фактора XII (см.выше) свидетельствуют о его многофункциональности. Основная функция фактора XII -активация фактора XI. Фактор XI состоит из двух идентичных цепей с высокой степенью гомологии прекалликреину. Подобно прекалликреину он существует в кровотоке в комплексе с ВМК. ВМК обеспечивает связывание фактора XI c отрицательно заряженной поверхностью и способствует его активации протеиназами, фактором XIIа, XIа и тромбином,каждый их которых расщепляет в мономерах фактора XI пептидную связь Arg 369- Ile 370.

Фактор XI активирует фактор IX в IXa. На уровне IX фактора объединяются внутренний и внешний пути свертывания. Физиологическое значение внутненнего пути не ясно, хотя участие контактной фазы в процессах воспаления не вызывает сомнений. Показано,что недостаточность фактора XII не ведет к кровоточивости,напротив обнаружена склонность к тромбообразованию. Приобретенная недостаточность факторов контактной фазы выявлена у пациентов с новообразованиями, сепсисом, аллергическими реакциями. Пептид, брадикинин, освобождаемый из ВМК калликреином, является модулятором тонуса сосудов. Образование фактора IXa -общая стадия внутреннего и внешнего пути, согласно устаревшему представлению о механизме свертывания крови в нормальном физиологическом процессе гемостаза.

2.4 Внешний путь свертывания крови – основной механизм образования тромбина в кровотоке.

    К настоящему времени доказано, что внешний путь свертывания крови, индуцируемый тканевым фактором, является основным механизмом образования тромбина в кровеносном русле (Рис 3). Стимулом к активации внешнего пути свертывания служит экспонирование на поверхности поврежденных клеток сосудистой стенки тканевого фактора, называемого так же тромбопластином (син. фактор III свертывания крови). 

   Существуют два пути образования комплекса тканевого фактора с фактором VIIa свертывания крови.     Первый – прямое связывание тканевого фактора с фактором VIIa, присутствующим в кровотоке в очень низкой концентрации (1% фактора VII) в конформации, не позволяющей ему контактировать с плазменными факторами свертывания и активировать их. Тканевой фактор – аллостерический активатор фактора VIIa, связывает фактор,изменяет его конформацию и каталитические свойства, повышая протеолитическую активность протеиназы в отношении специфических субстратов – факторов IX и X свертывания крови в несколько тысяч раз. 

Второй путь – связывание тканевым фактором фактора VII крови, последующее превращение его в активную форму (VIIa), расщеплением одной пептидной связи Arg152-Ile153 фактором Xa и образование активной двухцепочечной молекулы фактора VIIa, субединицы которой соединены дисульфидной связью.

     Тканевой фактор (CD142)– 47кДа трансмембранный гликопротеин, член суперсемейства рецепторов цитокинов класса II со значительной степенью гомологии с классом рецепторов интерферона. Тканевой фактор имеет одну полипептидную цепь, состоящую из N-концевого внеклеточного домена (219 а.о. (аминокислотных остатков)), гидрофобного трансмембранного участка (29 а.о.) и С-концевого внутриклеточного “хвоста” (21 а.о.). Внеклеточная часть молекулы тканевого фактора состоит из двух доменов, подобных доменам типа III фибронектина. Заякоревание тканевого фактора на мембране клетки существенно для связывания с высоким сродством факторов VII /VIIa, поддержки протеолитической активности фактора VIIa и инициирования свертывания крови.

 

 

 Клетки, контактирующие с кровью, такие как эндотелиальные клетки, моноциты в норме не экспрессируют тканевой фактор, формируя дефицитный по тканевому фактору барьер между фактором VIIa и внесосудистыми его источниками.

    Тканевой фактор конститутивно экспрессируется клетками субэндотелия, а также фибробластами и ГМК. Тканевой фактор обнаружен в адвентиции сосудов и в перицитах микрососудов мозга. На лейкоцитах и клетках эндотелия тканевой фактор экспонируется в ответ на воспалительные стимулы и повреждение клеток. Тканевой фактор может содержаться в циркулирующей крови в микрочастицах, освобождаемых при активации клеток, и в a-гранулах тромбоцитов в неактивной форме и/или в очень низкой концентрации.

Моноциты, активированные при воспалении, синтезируют тканевой фактор, которой заякорен в специализированных микродоменах, так называемых “ липидных плотах”. Эти домены служат источником микрочастиц, богатых фосфатидилсерином и тканевым фактором. Микрочастицы, транспортирующие тканевой фактор, адгезируют с активированными тромбоцитами, нейтрофилами и моноцитами, концентрируются в участке повреждения сосуда и иммобилизованный тканевой фактор стимулирует тромбообразование.  

        Тканевой фактор обнаружен в микрочастицах в крови больных инфарктом миокарда, антифосфолипидным синдромом, сепсисом и др.

    Итак, тканевой фактор служит кофактором и рецептором сериновой протеиназы - фактора VIIa и профермента – фактора VII. Фактор VIIa в комплексе с тканевым фактором (ТФ/VIIa) запускает каскад активации проферментов в активные протеазы и активирует рецепторы PAR на фибробластах, эпителиальных и эндотелиальных и других клетках.

      Образование сериновых протеаз гемостаза. Фактор VII- зависимый от витамина К, одноцепочечный, гликозилированный мультидоменный белок (406 а.о.), содержит N-концевой g-карбоксиглутаминовый домен (Гла-домен), содержащий 10 остатков g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), и каталитический (протеазный) домен, гомологичный трипсину и химотрипсину по аминокислотной последовательности. Доменная структура молекулы белка и организация гена фактора VII подобны таковым других витамин К зависимых факторов – IX, X, протеина С и протеина S (Рис). 

Рентгеноструктурным анализом кристаллической структуры комплекса растворимой формы тканевого фактора (лишенной трансмембранного и цитоплазматического домена) и ингибированного по активному центру фактора VIIa показано, что фермент, связанный с мембраной через Гла-домен, имеет протяженные контакты с тканевым фактором. Тканевой фактор подобен стержню, включенному в фосфолипидные везикулы мембраны, вокруг которого “закручивается” молекула фактора VIIa. Основные участки контакта фактора VIIa с тканевым фактором локализованы в первом EGF домене и каталитическом домене, а дополнительные точки контакта – в гидрофобном стеке, Гла-домене и втором EGF домене. Благодаря такому контакту комплекс ТФ/VIIa ориентирован перпендикулярно поверхности мембраны.

Тканевой фактор изменяет локализацию и ориентацию активного центра фактора VIIa относительно мембраны: расстояние от активного центра фермента до мембраны уменьшается, что способствует эффективному расщеплению пептидных связей субстратов (факторов X и IX), также связанных с мембраной через Гла-домены.

Взаимодействие фактора VII с тканевым фактором является зависимым от ионов кальция(Са²⁺). Девять участков молекулы фактора VII участвуют в связывании Са²⁺: семь сайтов в Гла-домене, один – в EGF I домене и еще один в каталитическом домене. Для высокоаффинного связывания фактора VII с тканевым фактором очень важно низкоаффинное(Kd < 1mM) связывание Са²⁺   с Гла-доменом.

  Комплекс ТФ/VIIa связывает фактор X и превращает его в фактор Xа.

В отличие от других зависимых от витамина К факторов протромбинового комплекса фактор X состоит их двух цепей, соединеных дисульфидной связью. Легкая цепь (139ао) содержит в структуре N-концевой Гла-домен с 11 остатками g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), в первом их которых локализован β-гидроксилированный Asn63. Тяжелая цепь(306 ао), содержащая все углеводы фактора X, содержит на N-конце гликозилированный пептид активации (52ао) и каталитический ( протеазный) домен.

 

ТФ/VIIa образуя тройной комплекс с фактором X (ТФ/VIIa/X) расщепляет его со скоростью в 2х10⁷ раз большей, чем свободный фактор VIIa. Комплекс ТФ/VIIa отщепляет N- концевой пептид активации, гидролизуя одну связь Arg194-Ile195 в тяжелой цепи, что приводит к образованию каталитически активного фактора Xа(триада активного центра - His236,Asp282 и Ser379). Молекула фактора Xа остается ассоциированной с комплексом через N- концевой Гла –домен легкой цепи.

   Моделирование структуры комплекса TФ/VIIa/Xa с помощью докинга (анализа комплементарности третичных структур) и сайт-направленного мутагенеза, показало, что фактор Xа имеет протяженную конформацию, подобную структуре фактора VIIa в комплексе TФ/VIIa. Во взаимодействии с TФ/VIIa участвуют все домены фактора Xа, в том числе аминокислотные остатки Glu51 и Asn57 первого домена EGF, Asp92 и Asp95 второго EGF домена и Asp185a, Lys186, и Lys134 каталитического домена фактора Xа.

 N-конец каталитического домена ориентирован таким образом, что может осуществляться как активация фактором Xа фактора VII,связанного с тканевым фактором, так и активация фактором VIIa профермента - фактора X.

Следует подчеркнуть, что комплекс ТФ/VIIa имеет чрезвычайно узкую субстратную специфичность, активируя ограниченным протеолизом только факторы X и IX.

                

      Вначале образуется небольшое количество (пкМ) фактора Xa, который не только активирует фактор VII, связанный с тканевым фактором, но также стимулирует появление следовых (нМ) концентраций тромбина, достаточных для активации кофакторов - факторов V и VIII - в активные формы (факторы Va и VIIIa), а так же для активации рецептора PAR1 тромбоцитов, эндотелия и активации антикоагулянтной системы протеина С благодаря связыванию с рецептором- тромбомодулином эндотелия. Эта медленная фаза инициации свертывания (РИС 5).

  Вслед за стадией инициации следует быстрая фаза распространения свертывания. Комплекс фактор TФ/VIIa активирует фактор IX в протеиназу – фактор IXа.

        Фактор IX свертывания крови - зависимый от витамина К, одноцепочечный, гликозилированный мультидоменный белок (415 а.о.), содержит N-концевой Гла-домен, содержащий 12 остатков g-карбоксиглутаминовой кислоты, гидрофобный стек, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF-домены), и каталитический протеазный домен(Рис).

    Отщепление пептида активации в результате последовательного гидролиза двух связей Arg145-Ala146 и Arg180-Ile181 комплексом ТФ/VIIa приводит к формированию сериновой протеиназы - фактора IXа, с триадой активного центра (His221,Asp269 и Ser365). 

     Фактор IXа, связанный с фосфолипидами мембраны клетки и ионами Са образует с фактором VIIIa комплекс, называемый тенназой. В структуре фактора IXа локализован мотив основных аминокислотных остатков, среди которых Arg333 играет ключевую роль в связывании фактора IXа с фактором VIIIа. Активационный комплекс тенназа превращает фактор X в протеазу – фактор Xа с каталитической эффективностью, превосходящей более чем в 10⁵ раз эффективность одной протеиназы.

   На поверхности мембраны клетки в присутствии ионов кальция фактор Xa образует комплекс с фактором Va, называемый протромбиназой.      Этот комплекс, также как тенназа, в 10⁵ -10⁶ раз более активен, чем входящяя в него сериновая протеиназа - фактор Xa. 

В структуре фактора Xa локализованы участки высокоаффинного связывания с фактором Va. Это прежде всего N-концевой Гла-домен легкой цепи фактора Xa, а также экспонированный на поверхность участок петли гепарин-связывающего экзосайта с кластером основных аминокислотных остатков. Мутации в структуре положительно заряженной петли фактора Xa по остаткам Arg165 (соответствующего Arg333 в структуре фактора IXa) и Lys 169 снижают сродство фермента к фактору Va в 4-7 раз. Это свидетельствует о ключевой роли этих основных остатков в узнавании ферментом -фактором Xa, своего кофактора, фактора Va, а фактором IXa - кофактора, фактора VIIIa.

Тромбин, который генерируется из протромбина под действием протромбиназы, усиливает свое собственное образование по механизму положительной обратной связи, активируя фактор XI в протеазу – фактор XIа, в свою очередь активирующий фактор IX.

Врожденная недостаточность фактора IX и его кофактора VIII фактора(вследствие дефектов структуры их генов (Табл.4))  ассоциируется с гемофилиями В и А соответственно. Если бы гемостаз осуществлялся через прямую активацию фактора X комплексом тканевой фактор – факторVIIa, то участие фактора IX не было бы столь необходимым и его недостаточность не приводила бы к гемофилии. Гемофилия А, наследуемая по сцепленному с X-хромосомой типу, встречается с частотой 1,3-1,8 на 10000 мужчин, а гемофилия В (ген фактора IX также локализован в X-хромосоме) – в 4 раза реже. Описано более 600 различных мутаций в генах факторов VIII и IX. Оба типа гемофилий- заболевания, связанные с полом. Если мужчина – гемофилик (с одной аномальной X-хромосомой) и здоровая женщина (с двумя нормальными X-хромосомами) имеют детей, то все дочери будут носителями дефектной хромосомы, а сыновья будут здоровыми. Женщины -носители гена гемофилии не имеют тенденции к кровоточивости,поскольку наследуют нормальный аллельный ген от матери, обеспечивающий 50% активности FVIII от нормы. Но если женщина –носитель гена гемофилии имеет детей от здорового мужчины, ее сыновья имеют шанс унаследовать гемофилию в 50% случаев, а дочери, так же в 50% случаев, могут быть носителями гемофилии. Около 1/3 больных гемофилией не имеют семейного происхождения заболевания. Эти спародические случаи возникают вследствие новых мутаций в Х- хромосоме, несущей гены факторов VIII и IX.

 

  Доказательством важной роли внешнего пути для осуществления свертывания крови было открытие ингибитора TFPI(ингибитора пути тканевого фактора) (Рис 5, Таблица 4). TFPI принадлежит к семейству трехглавых ингибиторов Кунитца и состоит из тандема трех доменов Кунитца (К1, К2 и К3), из которых первый (К1) ингибирует фактор VIIa, связанный с тканевым фактором, а второй (К2) – фактор Xa. Третий домен не имеет ингибиторной активности к протеазам, но в его структуре (прежде всего в положительно заряженной С–концевой последовательности молекулы TFPI) локализован участок связывания протеогликанов эндотелия, таких как синдеканы и глипиканы. TFPI специфично связывается с тромбоспондином-1 тромбоцитов.

Этот ингибитор обнаружен в плазме в относительно низкой концентрации, а также в эндотелии сосудов и тромбоцитах. Когда тканевой фактор появляется на поверхности активированных клеток, TFPI ингибирует инициирование каскада свертывания следующим механизмом. Сначала TFPI с высоким сродством связывает фактор Xa и образует с ним комплекс (через второй домен), затем связывается (через С-конец третьего домена) с отрицательно заряженными протеогликанами мембраны клеток. Повышается локальная концентрация ингибитора. Затем TFPI связывает фактор VIIa и инактивирует комплекс TФ/VIIa. Таким механизмом контролируется и ограничивается образование фактора Xa. Поэтому для появления эффективных концентраций фактора Xa в условиях in vivo (достаточных для генерации относительно высоких концентраций тромбина и свертывания фибриногена) необходима генерация наряду с комплексом фактор VIIа - тканевой фактор также комплекса фактора IXa с фактором VIIIa.

TFPI блокирует способность TФ/VIIa активировать фактор X и клетки через рецепторы, активируемые протеиназами.

Тройной комплекс ТФ/VIIa/X активирует PAR 1 и 2 на клетках. Присоединение фактор Xа к комплексу TФ/VIIa повышает в 5 раз интенсивность клеточного ответа по сравнению с действием одного фактора Xа (см. глава 5). Тканевой фактор активирует клетки протеолитическим механизмом, зависимым от фактора VIIa свертывания крови, в котором тканевый фактор работает как кофактор и модулятор фактора VIIa. Связывание фактора VIIа с тканевым фактором стимулирует передачу запуск внутриклеточной сигнализации, приводя к повышению внутриклеточного Ca²⁺, фосфорилированию активируемых митогеном протеинкиназ, транскрипционных факторов и, в конечном счете, к синтезу и экспонированию адгезивных белков, ответственных за адгезию и миграцию клеток.

Итак, процесс свертывания поддерживается активацией фактора IX.       Факторы IXa и Xa проявляют свою активность при ассоциации с неферментативными кофакторами-факторами VIIIa и Va, соответственно (Таблица 4). Факторы V и VIII -большие гликопротеиды, которые активируются протеолизом определенных связей фактором Xa или тромбином. Активные кофакторы - Va и VIIIa, состоят из субединиц, стабилизированных Са²⁺, и связываются с отрицательно заряженными фосфолипидами мембран, протеиназами- факторами Xa и IXa, и субстратами этих ферментов – протромбином и фактором X.

 Протромбиназный комплекс (факторы Ха,Va,Са2+и фосфолипиды мембран) превращает протромбин в тромбин. В стехиометрическом комплексе фермента- фактора Xa и кофактора- Va происходят конформационные изменения в активном центре фактора Xа,облегчая взаимодействие фермента с субстратом-протромбином. Протромбин,связываясь с фактором Va и Xa, также претерпевает изменения, обеспечивающие эффективное взаимодействие между ферментом-фактором Xa и субстратом. Скорость реакции возрастает более чем на 5 порядков. Это увеличение происходит как за счет повышения сродства фермента к субстрату (снижения каталитической константы- Km), так и за счет повышения скорости реакции (возрастания каталитической константы-kcat).