Особливості перебігу процесу ферментації

 

У сучасних умовах найбільш перспективним методом вирощування мікроорганізмів-продуцентів антибіотиків визнаний метод глибинного культивування. Метод полягає в тому, що мікроорганізми розвиваються в товщі рідкого поживного середовища, через яке безупинно подається стерильне повітря, і за постійного перемішування.

Існує чотири основні модифікації глибинного способу вирощування мікроорганізмів:

1. Періодичне культивування. У цьому способі весь процес розвитку мікроорганізмів повністю завершується в одному ферментері, після чого ферментер звільняється від культуральної рідини, ретельно промивається, стерилізується й знову заповнюється свіжим поживним середовищем. Середовище засівається продуцентом, і процес відновляється.

2. Метод відбору. Культивування мікроорганізмів здійснюється у ферментерах з періодичним відбором частини об'єму культуральної рідини і доведенням свіжим поживним середовищем до попереднього рівня.

3. Батарейний спосіб. Мікроорганізми розвиваються в ряду послідовно з'єднаних ферментерів. Культуральна рідина на певній стадії розвитку мікроорганізму перекачується з першого ферментера в другий, потім із другого в третій і т.д. Звільнений ферментер відразу заповнюється свіжим поживним середовищем, засіяним продуцентом. У цьому способі вирощування мікроорганізмів місткості використовуються більш раціонально.

4. Безперервне культивування. В основі методу лежить принцип безперервного потоку поживного середовища, що дозволяє підтримувати розвиток мікроорганізму на певній стадії його росту. Стадія розвитку мікроорганізму визначається тим, що в цей період відбувається максимальний біосинтез антибіотика або іншої біологічно активної сполуки. Встановлено, що в умовах безперервного процесу біосинтезу деяких антибіотиків можна одержати чудові результати, якщо процес вести у дві стадії. У першому апараті батареї підтримують високу швидкість потоку, що забезпечує більшу швидкість росту продуцента антибіотика, для того, щоб одержати високоактивну біомасу, а в другому апараті – забезпечують низьку швидкість потоку й відповідно невелику швидкість росту. Процес безперервного культивування – перспективний напрямок сучасної біотехнології.

Розвиток мікроорганізму у ферментерах проходить за суворого контролю всіх його стадій і точного виконанням регламенту умов розвитку. Велику увагу приділяють підтримці заданої температури культивування, активної кислотності середовища (рН), ступеня аерації й швидкості роботи мішалки. У процесі розвитку організму здійснюють біологічний контроль, враховують споживання організмом основних компонентів субстрату (джерела вуглецю, азоту, фосфору), уважно стежать за утворенням антибіотика. Проводити біологічний контроль на досить високому рівні дозволяє використання сучасного комп’ютерного забезпечення та автоматизованих систем управління.

Велике значення для утворення пеніциліну має аерація культури. Максимальне накопичення пеніциліну відбувається за інтенсивності аерації, що дорівнює 1 од. об’єму повітря за 1 хв. на 1 од. об’єму середовища. Зменшення інтенсивності аерації або надмірне збільшення призводять до зниження біосинтезу пеніциліну. Важливу роль при цьому відіграє перемішування культури. Так, із збільшенням потужності, що витрачається на обертання мішалки у ферментері об’ємом 7500 л, швидкість споживання лактози збільшується і біосинтез антибіотика зростає (рис. 4). Від способу перемішування культуральної рідини залежить форма і величина глибинних колоній, стан яких визначає міру здатності міцелію до синтезу пеніциліну [6].

 

Рис. 4. Графік залежності накопичення пеніциліну від інтенсивності перемішування.

Велику увага в процесі розвитку продуцента у ферментерах звертають на процес піногасіння. Під час продування повітря через культуру мікроорганізму утворюється піна, яка суттєво порушує процес розвитку продуцента антибіотика у ферментері. Поява великої кількості піни обумовлена білковими речовинами, що знаходяться у середовищі, і її високою в'язкістю, що пов'язано з інтенсивним накопиченням біомаси.

Для боротьби з піною у ферментерах використовують поверхнево активні речовини: рослинні олії (соєву, соняшникову), тваринний жир (лярд, китовий жир), а іноді мінеральні олії (вазелінову, парафінову), спирти й вищі жирні кислоти. Нерідко в якості піногасників використовують спеціально синтезовані речовини (силікони, диазобутананкарбаміл та ін.).

Багато речовин (олії, жири, спирти й ін.), використовувані в якості піногасників, споживаються продуцентами антибіотиків як додаткові джерела вуглецевого живлення. При цьому часто спостерігається підвищення виходу антибіотика. Однак внесення піногасника може знижувати швидкість розчинення кисню, що, у свою чергу, негативно позначається на розвитку мікроорганізму і його біосинтетичну активність.

Іноді використовуються механічні способи піногасіння (відсмоктування піни через спеціальні труби, руйнування пухирців піни сильними струменями рідини, пари або газу).

Загальна схема виробництва антибіотиків до стадії виділення й хімічного очищення представлена на рис. 5.

 

Рис. 5. Схема виробництва антибіотиків: I – приготування посівного матеріалу; II – інокулятори для нарощування посівного матеріалу; III – стерилізатор середовища для великого ферментера; IV – установка для біосинтезу антибіотика; а – стерилізація середовища в колбах; б – охолодження й посів культури продуцента в колбу; в – ріст культури в стані спокою; г – ріст культури в качалці; д – інокулятор зі стерильним середовищем; е – інокулятор із середовищем, засіяним культурою продуцента; є – ферментер;

 

Перша стадія процесу – вирощування стандартної колонії штамів плісняви Penicillium chrysogenum – проводиться в інокуляторах на поживному середовищі де процес іде ~30 годин. Підготовлений інокулят переносять у посівний апарат, об'єм якого ~ в 10 раз більше об'єму інокулятора. У посівному апараті знаходиться також стерилізоване поживне середовище. Процес росту тут іде ~15 – 20 годин, і далі посівний матеріал подається на ферментацію в більші реактори – ферментери об'ємом до 100 м³. Процес ферментації триває ~70 годин за температури 23 – 24 °С, рН середовища 6 – 6,5 і за інтенсивної аерації (1 од. об’єму повітря за 1 хв на 1 од. об’єму середовища) [2].

Для стабілізації реакції середовища використовують крейду. Коли кількість пеніциліну досягає максимуму ферментацію припиняють. Динаміка утворення міцелію, біосинтезу пеніциліну і споживання лактози із середовища зображено на рис. 6.

 

Рис. 6. Динаміка біосинтезу пеніциліну, утворення міцелію і асиміляції лактози: Х – сухий міцелій (мг/100 г), Р – концентрація пеніциліну (1000 од./мл), S – концентрація лактози (мг/мл).

 

Під час розвитку продуценту пеніцилінів – Penicillium chrisogenum – на кукурудзно-лактозному середовищі виділяють три фази.

Перша фаза – ріст міцелію, вихід антибіотика низький. Завжди присутня в кукурудзяному екстракті молочна кислота споживається продуцентом з максимальною швидкістю, лактоза споживається повільно. Споживання кисню – високе. Посилюється азотний обмін, в результаті чого в середовищі з’являється аміак і різко збільшується значення рН. Температура в період першої фази повинна бути 30 °С, рН в період росту гриба повинен бути нижче 7,0.

Друга фаза – максимальне утворення пеніциліну, це пов’язано із швидким споживанням лактози і амонійного азоту. рН середовища залишається практично без змін, збільшення маси міцелію незначне, споживання кисню знижується. Температура протягом другої фази повинна бути 20 °С,

Третя фаза – зниження концентрації антибіотика в середовищі у зв’язку із початком автолізу міцелію і виділенням в результаті цього процесу аміаку, що супроводжується підвищенням рН середовища.

На сьогоднішній день описано шість умовно виражених вікових фаз продуцента пеніциліну. Помітна кількість пеніциліну починає утворюватися з ІV вікової фази гриба, максимум накопичення припадає на VІ фазу – в період автолізу.

Визначення вікових фаз шляхом мікроскопічного контролю дозволяє встановити:

1. Хід загального темпу розвитку гриба, його стан, контроль за ходом утворення антибіотика.

2. Дефекти розвитку і можливі причини цих дефектів.

3. Момент закінчення розвитку гриба в реакторі.

По мірі розвитку гриба змінюється хімічний склад міцелію. Кількість загального азоту і білку в міцелії зменшується, вміст моноцукрів в період максимального біосинтезу пеніциліну (96 год.) збільшується майже в 6 разів по відношенню до початкового процесу, кількість дисахаридів зменшується. Змінюється кількість окремих амінокислот.

Процес біосинтезу пеніциліну ведеться за найретельнішого дотримання стерильності протягом усіх операцій, оскільки забруднення культури сторонньою мікрофлорою різко знижує накопичення антибіотика. Це пов’язано із тим, що багато бактерій здатні утворювати пеніцилазу.

Механізм біосинтезу пеніциліну зображений на рис. 7.

 

Рис. 7. Біохімія синтезу бензилпеніциліну

 

Сучасна промислова мікробіологія отримує культуральні рідини, що містять більше 55 тис. од./мл [1].