Спиноцеребеллярная атаксия 10-го типа.

СЦА10 – аутосомно-доминантное заболевание, связанное с экспансией пентануклеотидного повтора АТТСТ в девятом интроне гена SCA10. В норме повтор состоит из 10-22 пентануклеотидов. У больных с СЦА10 он претерпевает значительные экспансии, достигая 4500 повторяющихся единиц. Стандартные методики ПЦР позволяют амплифицировать только нормальные аллели повтора в гене SCA10. Для ПЦР-детекции аллелей, содержащих тысячи повторяющихся пентануклеотидов, применяется повтор-праймированная реакция.

В отличие от традиционного способа амплификации областей микросателлитов, использующего два локус-специфических праймера (назовём их условно Р1 и Р2), фланкирующих область собственно повтора, повтор-праймированная реакция основана на применении лишь одного специфического фланкирующего праймера (Р1) в сочетании с парой олигонуклеотидов (Р3 и Р4), гомологичных по 5’-участкам (рис. 19). Этот общий фрагмент последовательности праймеров Р3 и Р4 выбирается из случайно генерируемых последовательностей заданной длины. Критерии выбора последовательности концевого праймера включают (1) минимальную самокомплементарность, (2) отсутствие комплементерности с анализируемым микросателлитным повтором и (3) минимум гомологии с известными последовательностями генома человека. Праймер Р4 имеет участок, комплементарный последовательности целевого микросателлита на 3’-конце.

На первых циклах ПЦР повтор-специфичный 3’-конец праймера Р4 отжигается случайным образом на различных участках последовательности микросателлитного повтора, что приводит к образованию смеси продуктов амплификации различной длины. Специфичность амплификации именно целевого микросателлита обеспечивается локус-специфичным праймером Р1. Неравновесное молярное соотношение праймеров Р3 и Р4, составляющее 10:1, обеспечивает полное истощение Р4 на ранних циклах ПЦР. Этим прекращается дальнейшее праймирование последовательности микросателлита, которое по мере нарастания количества циклов амплификации приводило бы к прогрессивному укорочению средней длины продуктов ПЦР.

Флуоресцентная повтор-праймированная ПЦР позволяет достоверно отличить образцы ДНК больных СЦА10 от контрольных образцов по наличию протяженной «лестницы» пиков, соответствующих продуктам амплификации с длинами, превышающими нормальные значения (рис. 20, нижняя панель). Картина пиков характеризуется периодичностью в 5 нуклеотидов, составляющих коровую единицу микросателлитного повтора в гене SCA10,и прогрессивным снижением интенсивности сигналов по мере возрастания длин фрагментов. Нормальные генотипы вычисляются путем прибавления к общему числу детектируемых пиков количества коровых единиц повтора, входящих в состав 3’-конца праймера Р4 (рис. 19, верхняя панель).

Метод повтор-праймированной ПЦР может в принципе использоваться для диагностики масштабных экспансий микросателлитных повторов при любой из болезней экспансии некодирующих повторов.

Атаксия Фридрейха

Атаксия Фридрейха (АФ) – заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования. Этим объясняется тот факт, что АФ - единственная болезнь экспансии некодирующих микросателлитных повторов, при которой не отмечено антиципации. Клинические проявления заболевания включают атаксию, дизартрию, ослабление рефлексов, кардиомиопатию и диабет. При атаксии Фридрейха показана дегенерация нейронов спинного мозга, ганглиев дорсальных корешков и некоторых периферических сенсорных систем. Заболевание вызвано экспансией внутриинтронного повтора GAA в гене Х25 (ген фратаксина), приводящей к снижению экспрессии гена. Предполагается, что возникающая в результате экспансии протяженная повторяющаяся АТ-богатая последовательность образует необычные структуры, затрудняющие нормальную транскрипцию.

Метод повтор-праймированной ПЦР эффективно выявляет все варианты генотипов GAA-повтора в гене фратаксина (рис. 21).

 

5.5. Экспансии некодирующих повторов, ассоциированные с экспрессией ломких хромосомных участков.

Ломкими (фрагильными – от англ. fragile, хрупкий) хромосомными участками называются районы с повышенной частотой возникновения цитогенетически определяемой ломкости после культивировании клеток в особых условиях. Хроматин в ломких участках не компактизируется при подготовке клетки к митозу. Ломкие участки классифицируются прежде всего по их распространённости в нормальной популяции. Распространённые (общие) ломкие участки рассматриваются как элементы нормальной структуры хромосом, однако степень их экспрессии индивидуальна и у разных представителей одной популяции может различаться. Частота редких участков варьирует от 1 на 40 хромосом для FRA16B и 1 на 80 для FRA10B до единичных случаев (например, FRA1M в 1р21.3).

Как редкие, так и общие ломкие участки подразделяются в соответствии с условиями культивирования, необходимыми для индукции их цитогенетической экспрессии. Подавляющее большинство клонированных к настоящему моменту ломких участков относятся к группе редких фолатчувствительных. Эти ломкие участки содержат полиморфные повторы (CGG)n. Экспансия таких повторов представляет собой динамическую мутацию, проходящую в своём развитии две стадии: премутации и полной мутации. Премутации (обычно 55-230 триплетов) характеризуются значениями длины повтора, превышающими нормальные, но не сопровождающимися экспрессией ломкого участка. Превышение порогового значения длины тринуклеотидного повтора приводит к метилированию CpG-динуклеотидов в повторе и экспрессии ломкого участка. Такое состояние называется полной мутацией.

In vitro фолатчувствительные ломкие участки экспрессируются при пониженной концентрации dTTP или dCTP в культуральной среде. Такие условия создаются при дефиците фолиевой кислоты (отсюда название – фолатчувствительные ломкие участки) или тимидина, либо при добавлении ингибиторов метаболизма фолата (метотрексат). Предполагается, что в условиях дефицита dCTP репликация не может быть завершена в стандартные сроки. В результате ломкий участок представляет собой участок однонитевой ДНК, премитотическая компактизация которой нарушена.

Вторым обязательным условием экспрессии фолатчувствительных ломких участков является пребывание CGG-повтора в состоянии полной мутации. В то время, как дефицит dTTP или dCTP нарушает репликацию в области ломкого участка, метилирование полной мутации нарушает нормальную структуру хроматина.

Очевидно, эти два условия являются обязательными, но не исчерпывающими, поскольку при полном их соблюдении до сих пор не удается получить более чем 30% экспрессию ломкости.

Выявление в 1969 г. ломкого участка, расположенного на границе Xq27 и Xq28 и получившего позднее название FRAXA(рис. 22) у мужчин с умственной отсталостью (УО) явилось первым лабораторным диагностическим признаком одной из болезней экспансии тринуклеотидных повторов - синдрома Мартина-Белл (СМБ). В то же время были описаны семьи, у членов которых проявлялись клинические признаки СМБ, но не экспрессировался FRAXA. С другой стороны, были отмечены случаи сегрегации фолатчувствительного ломкого участка в X(q27.3-q28), не сопровождавшиеся фенотипом УО. В сочетании с невозможностью достичь хотя бы 50%-ной экспрессии фолатчувствительного ломкого сайта у больных и наличием фонового уровня хромосомной ломкости в области Xq27, перечисленные факты говорят о неудовлетворительной чувствительности и специфичности цитогенетической диагностики состояний, ассоциированных с ломкими хромосомными участками. Даже если на основании клинических признаков и анализа родословной высказывается подозрение на синдром Мартина-Белл, технически не всегда легко обнаружить патогномоничный ломкий сайт в Xq27.3. Цитогенетический анализ даёт особенно низкий диагностический выход при анализе носительства у женщин. Кроме того, цитогенетическая диагностика СМБ нередко приводит к ложноположительным результатам. В проведенном нами исследовании цитогенетическая экспрессия фолатчувствительного ломкого участка в длинном плече Х-хромосомы документирована для 3% больных с УО (17 из 470). В дальнейшем при использовании молекулярно-генетических методов анализа, было выявлено 18% (3 из 17) ложноположительных диагнозов СМБ, поставленных на основании выявления фолатчувствительных ломких хромосомных участков. Ложноотрицательных диагнозов СМБ, поставленных на основании выявления хромосомной ломкости, не отмечено. Полученные данные согласуются с результатами исследований, проведённых в ряде стран мира: при молекулярно-генетическом анализе образцов крови больных с диагнозом СМБ, поставленным ранее на основании выявления фолатчувствительных ломких участков Х-хромосомы, значительная часть диагнозов признана ложноположительными. В свете этой информации оценки частоты СМБ в общей популяции стали более скромными: 1: 3000-4000 мужчин в настоящее время против 1: 1000 в конце 80-х гг. Развитие молекулярно-генетических методов, ставшее возможным после идентификации генов соответствующих заболеваний, открыло новые возможности лабораторной диагностики и значительно повысило её достоверность.

Наиболее изучены с точки зрения молекулярной структуры три фолат-чувствительных ломких участка, расположенные в пределах относительно небольшой, немногим более 1 м.н.п., области длинного плеча Х-хромосомы. Это ломкий сайт FRAXA (Xq27.3) и ломкие сайты FRAXE и FRAXF, расположеные в Xq28 на расстоянии около 600 т.н.п. и 1200 т.п.н. от FRAXA соответственно (рис. 23). Все три участка содержат нестабильные тандемные CG-богатые повторы, экспансия которых приводит к аномальному метилированию прилежащих CpG-островков.