Георгафічне поширенн А-вірусу винограду

Зазавичай вірус поширений в тому місці, де вирощується Vitis vinifera. Завезений вірус із Європи, Середземноморя, Середньої Азії, Вівденної Африки, Китаю, Австралії, Північної і Латинської Америки [9].

Поширення

Всі види передаються механічною інокуляцією. Передача щепленням і розгонем поміж посадковим матеріалом є спільним для всіх видів винограду, що можуть бути уражені вірусом. А-вірус винограду передається в напівперсистентній манері різними видами псевдоцикадок (pseudococcid mealybugs) родів Pseudococcus та Planococcus Даний вірус також передається комахою Neopulvinaria innumerabilis.

Вітівіруси передаються щепленням, посадковим матеріалом, борош- нистими червецями: псевдококцидами Pseudococcus affinis, Ps. longispinus, Planococcus citri, Pl. ficus, Phenacoccus aceris [33, 54], Heliococcus bohemicus [59], кокцидами Neopulvinaria innumerabilis, личинкою Parthenolecanium corni [29] і механічно.

Насінням винограду хвороба не передається.

Передача векторами

Вірус передається псевдоцикадками: pseudococcid mealy bugs Pseudococcus longispinus, Ps. affinis, Planococcus ficus, Pl. citri [47] і борошнисто-черревною цикадкою Neopulvinaria innumerabilis. Передача завдяки Ps. longispinus і Pl. ficus є напівперсиситентною.

Вірус переноситься після того, як комаха зїла уражену рослину і протягом наступних 15 хв скуштувала здорову. Оптимальним часом для зараження є 1-3 години. Вірус зберігається в передній частині травного каналу Ps. longispinus.

А-вірус винограду не передається попелицями: Myzus persicae and Macrosiphon euphorbiae [14].

Передача через щеплення

Вірус легко передається з винограду на виноград через щеплення, яке представляє собою один із найголовніших механізмів поширення. Специфічний індикатор Кобер 5ВВ представляє типовий прояв зараження – стовбурові канавки, спричинене механічним або «зеленим» щепленням [64].

Штами

Два біологічних варіанти даного вірусу були виявлені в Канаді, але вони різнилися важкістю появлених симптомів на прикладі N. benthamiana, але дане дослідження проводилося не завдяки серологічним методам діагностики [64].

 

Методи діагностики А-вірусу винограду

Рання сучасна діагностика вірусних захворювань дозволяє швидко визна­чити якість посадкового матеріалу винограду [32, 58]. Одними із найнадійні­ших, найчутливіших і найспецифічніших методів діагностики є серологічні [25, 37, 58] і молекулярно-біологічні [2, 4, 21, 37]. Використання імуноферментного аналізу (ІФА) та полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР) уможливлює за короткий термін проведення скринінгу великої кіль­кості зразків та вивчення поширення збудників вірусних захворювань на вино­градниках [2, 25, 58].

Крім того, існують такі методи діагностики: візуальний, індексація щепленням на індикаторні сорти винограду (симптоми захворювання виявляються впродовж року щеплення, іноді на 2–3-й рік, залежно від виду вірусу), механічні перенесення на трав’янисті індикатори [21, 37, 44, 58]. Хоча, на жаль, вони і не завжди дають достовірні результати, згідно з міжнародними правилами при виробництві сертифікованого посадкового матеріалу винограду їх обов’язково використовують. Це пов’язано з тим, що на винограді можуть з’явитися нові невідомі віруси, які неможливо ідентифікувати за допомогою ІФА та ПЛР.

Серологія

Вірус є помірно імуногенним. Чотири моноклональних антитіл миші, щоб очистити вірусні частинки були зроблені з титрами від 1/8,000 до 1/32,000, з яких тільки один, похідний від поверхні антигенного детермінанта, окрасили всю частку вірусу завдяки використанню імуно-електронної мікроскопії [9]. Зішкріб кори зрілої лози - найкраще джерело антигена для серологічного тестування. DAS-ELISA з поліклональною антисироваткою може бути використано для виявлення вірусу у зараженій лозі, але нерівномірний розподіл і низька концентрація антигена в тканині рослини може впливати на достовірність цього тесту [8, 10].

Антисироватка отримана на основі рекомбінантного вірусного білка руху експресована в Escherichia coli була використана для чутливого виявлення вірусу в уражених тканинах виноградної лози та для ідентифікації внутрішньоклітинних місць накопичення білка руху [64].

Більш надійні результати виходять, коли поліклональна антисироватка використовуються для захоплення антигену в білок, потім фермент-кон'юговані моноклональні антитіла для виявлення антигену. Моноклональні антитіла виявляють вірус у N. benthamiana за допомогою блот - аналізу тканини.

Рис.1.12 Вірусні частнки засвічені завдяки вірус-специфічними антитілами, коньюговані колоїдним золотом. Шкала = 100 нм [64].

ELISA тести є досить простими і здатні дати результат за один або 2 дні. Для усішного проведення тестів ELISA анти сироватка для кожного збудника захворювання повинна знаходитися в лабораторії, а зразки винограду мають братися лише з відповідних тканин у потрібний час року, і бути в хорошому фізичному стані [11].

Однак, існує певне обмеження для проведення ІФА. Воно полягає в тому, що не до кожного вірусу винограду вироблені спеціальні сироватки. Таким чином, виноград може бути заражений певним вірусом, але якщо антисироватки проти цього вірусу не існує, то тести ELISA не будуть здатні його виявити.

Ще одна проблема, яка може завадити проведенню серологічних досліджень, - це чистота антисировотки. У деяких випадках сироватка може реагувати з більш ніж одним вірусом, або навіть з іншими компонентами рослинного соку, які були присутні з вірусом, коли антидот був зроблений. Це може призвести до неочікуваних результатів, або потенційно помилкових позитивних результатів [42].

ПЛР

Вивлення вірусу: А-вірус винограду

Методи: RT-PCR, and IC-RT-PCR

Загальні відомості

Вірусу був виділений із листків, пагонів і бруньок винограду. Дослідження було проведено за допомогою ПЛР зі зворотною транскрипцією (RT-PCR), Імунно – захоплююча зворотня транскрипційна ПЛР (Immuno-Capture reverse

transcription PCR).

 

Матеріали і методи

Для обох методів був обраний один і той самий набір праймера, який використовується для дослідженн А-вірусу винограду в тестованих зразках

Праймери:

Продукт ПЛР: 430 по білкового білка

Праймер 1 – комплементано-змістовний праймер: C995: 5’AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG 3’

Праймер 2 – антизмістовний праймер: H587: 5’GACAAATGGCACACTACG 3’ [27, 43, 45].

RT-PCR

Виділення РНК з стебла винограду і черешків для проведення ЗТ-ПЛР

1) Порізати зразок (0,5-0,7 г стебла або черешка) на шматки скальпелем і занурити у азотний розчин в ступці

2) Додати 5 обємів рослинної ваги в лимонному буфері (50 мМ, рН 5,6), що містить 2% PVP і 20 мМ of DIECA.

3) Подрібнювати дуже добре зразки за допомогою карборудмаксу (carborudpmax) до поки не отримаємо зелений розчин гомогенату.

4) Перемістити гомогенат в центрифужні пробірки і центрифугуваи при 10000 об/хв. Протягом 10 хв при температурі 4ºС.

5) Розподілити відібраний супернатант на аліквоти і зберігати при температурі –80ºC до використання.

6) Розвести екстракт до 40% в дистильованій воді, що містить 1% Triton X-100.

7) Інкубувати при 65ºC протягом 15 хв.