Изучение инсуляторов homie и nhomie дрозофилы

 

КУРБИДАЕВА А.С., ШИДЛОВСКИЙ Ю.В., ШЕДЛ П.

 

ИБГ РАН, МОСКВА; ПРИНСТОНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ, ПРИНСТОН, США

 

Цель: Геномы эукариот организованы в группы структурно и функционально автономных доменов с помощью особого класса регуляторных элементов, называемых инсуляторами. Инсуляторы работают в комбинации с другими инсуляторами и особыми инсуляторными белками, обеспечивая тонкую регуляцию экспрессии генов в развитии. Инсуляторы Homie и Nhomie были обнаружены в лаборатории Дж.Б.Джейнса из Университета Томаса Джефферсона при изучении регуляторной области гена парного правила even-skipped (eve). Гетерологичные взаимодействия между ними приводят к формированию хромосомной петли, включающей в себя промотор гена eve и его энхансеры, отвечающие ща специфичные паттерны экспрессии гена на разных стадиях эмбриогенеза. Инсуляторы также защищают промотор соседнего гена TER94 от взаимодействия с энхансерами eve. Данная работа направлена на изучение структуры инсуляторов Homie и Nhomie, а именно поиска нуклеотидной последовательности(ей), необходимой(ых) для связывания инсуляторных белков из ядерного экстракта с инсуляторыми на разных стадиях развития эмбриона. Идентифицированные элементы в дальнейшем будет использован для поиска как уже известных белков и белковых комплексов, так и новых, ранее не изученных инсуляторных белков, связывающихся с Homie/Nhomie и обеспечивающих их активность.

Методы: (1) Компьютерный анализ баз полногеномных данных (ChIP-Seq); (2) Гель-шифт анализ для нахождения нуклеотидных последовательностей внутри Homie и Nhomie, необходимых для взаимодействия с инсуляторными белками. Для этого будут использоваться эмбриональные ядерные экстракты дрозофилы из эмбрионов, находящихся на двух стадиях развития: ранней (0-6 ч) и поздней (9-18 ч). Метод EMSA позволит по изменению подвижности комплексов белок-ДНК по сравнению с фрагментом ДНК судить о наличии сайтов связывания инсуляторных белков. В качестве матрицы для связывания будут использованы различные области инсуляторов.

Результаты: Анализ баз данных полногеномного распределения сайтов связывания известных инсуляторных белков дрозофилы показал, что большинство из известных инсуляторных белков связываются с Homie и/или Nhomie: CTCF, Mod(mdg4), Su(Hw), CP190, BEAF32, Zw5, GAF, Elba. Гель-шифт анализ позволил обнаружить 3 сайта в Homie и один сайт в Nhomie, с которыми связывается инсуляторный комплекс LBC, функционирующий в комплексе Биторакс, отвечающем за развитие парасегментов. Также обнаружен ряд кандидатных последовательностей, с которыми связываются ранее неизученные белковые комплексы из раннего и позднего ядерного экстракта.

Обсуждение: Гетерологичные взаимодействия между инсуляторами приводят к формированию петель, организующих хроматин в домены. Полученные данные позволяют предполагать, что комплекс LBC способствует организации хроматиновой петли в локусе eve путем взаимодействия с Homie и Nhomie. Однако, он присутствует только на поздней стадии развития эмбриона. Другие последовательности и белки отвечают за активность Homie/Nhomie на ранней стадии развития.

Выводы: Получено экспериментальное подтверждение связывания инсуляторного комплекса LBC с инсуляторами Homie/Nhomie с помощью EMSA. Обнаружен ряд последовательностей, с которыми связываются ранее не изученные белки и комплексы.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 16-34-00509 мол_а).

 

 

ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ У МЫШЕЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ НАГРУЗКИ ОРГАНИЗМА ЖЕЛЕЗОМ

ЛЕОНОВ В. В.¹, ПАЧГАНОВ С. А.¹, ЛЕОНОВА Л. В.¹, БУЛАТОВ И. А^.1, МИРОНОВ А. Ю.²,

¹БУ «ХАНТЫ-МАНСИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ», ХАНТЫ-МАНСИЙСК

²ФБУН «МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМ. Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО» РОСПОТРЕБНАДЗОРА, МОСКВА

 

S. aureus по своей вирулентности приближается к облигатно патогенным микроорганизмам, что связано с широким арсеналом его факторов патогенности. Основные из них локализованы в хромосомном локусе argABCD. Экспрессия генов данного локуса кворум-зависима и находится под контролем двухкомпонентной регуляторной системой Arg. Транскриптами генов локуса локусе argABCD являются РНК II и РНК III, первая содержит основные arg-гены. РНК III обеспечивает регуляцию синтеза факторов вирулентности (ДНК-азы, фибринолизина, энтеротоксина, α-, β-, δ-токсинов и др.). Ген spaA, кодирует синтез поверхностного протеина А, важного фактора адгезии и колонизации S. aureus, способствующего образованию биоплёнок. Изучение особенностей экспрессии этих генов в зависимости от условий позволит выяснить инфектологические механизмы стафилококковой инфекции.

Цель. Изучить влияние состояния обмена железа на экспрессию факторов патогенности S. aureus при экспериментальной инфекции.

Методы. Для работы был использован клинический изолят из крови S.aureus 545. Моделирование железодефицитной анемии (ЖДА) и гемосидероза (ГС) осуществлялось на лабораторных мышах CD-1 введением десферриоксамина и сульфата железа(III) соответственно. Заражение животных осуществляли внутрибрюшинно (доза 1/2LD50 на мышь) и выводили из эксперимента через 72 ч после заражения. Для изучения экспрессии генов была выбрана печень, как наиболее обсемененный орган по данным бактериологического метода. Экспрессия генов определялась с помощью ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией. В качестве гена «домашнего хозяйства» использован универсальный праймер для гена бактериальной 16S рРНК. Праймеры и наборы для обратной транскрипции произведены ЗАО Евроген (Россия). Для проведения ПЦР использован термоциклер CFX 96 (Bio-Rad, США).

Результаты и обсуждение. Микробная обсеменённость внутренних органов была наибольшая в группах мышей с ЖДА и ГС по сравнению с группой с нормальным вариантом обмена железа. При ЖДА наблюдалось развитие сепсиса и его фатальное течение. Изучение экспрессии РНК III выявило, что при ЖДА и ГС, по сравнению с нормой, экспрессия генетического локуса argABCD увеличивалась в 2,5 и 10,0 раз соответственно. Аналогичные результаты получены для экспрессии гена протеина А spaA. При избытке железа экспрессия гена spaА увеличивалась по отношению к норме в 167,6 раз, в случае дефицита железа лишь в 9 раз. В организме животных с нормальных обменом железа происходило подавление роста S. aureus, что ингибировало кворум-зависимую регуляцию экспрессии факторов патогенности локуса argABCD. Полученные результаты объясняют широкую распространённость стафилококкового сепсиса. Поскольку независимо от состояния обмена железа (ЖДА или ГС) организма хозяина вирулентность S.aureus увеличивается и происходит его транслокация из брюшной полости во внутренние органы.