Структурно-функциональные изменения тимуса при старении

Морфологическая инволюция тимуса начинается с 1 года жизни и выражается в непрерывном уменьшении его массы в течение жизни в основном за счет замещения коркового слоя соединительной тканью. К 50-60 процесс инволюции тимуса достигает своего максимума и далее практически не прогрессирует. У людей пожилого возраста большая часть долек тимуса замещена жировой и соединительной тканями, что делает невозможным различить корковый и мозговой слои. Клеточное микроокружение тимуса при достижении среднего возраста у человека уменьшается на 3-5%, а затем менее чем на 1% ежегодно. В сохранившихся дольках наблюдается гипоплазия и уменьшение числа тимоцитов, располагающихся в виде скоплений по 5-6 клеток. Снижение количества тимоцитов при инволюции вилочковой железы вызвано ослаблением способности эпителиальных клеток тимуса привлекать костномозговые клетки-предшественники, обеспечивать их дифференцировку, пролиферацию и поддерживать выживаемость. При изучении ультраструктуры микроокружения тимоцитов у старых крыс отмечался лизис мембран клеток и появление многочисленных липидных включений, что, вероятно, так же служило одной из причин снижения количества Т-лимфоцитов и дендритных клеток тимуса при старении. Несмотря на значительные морфофункциональные изменения в тимусе, ассоциированные с возрастом, имеются данные, что вилочковая железа сохраняет способность к синтезу некоторых гормонов и дифференцировке Т-клеток даже в возрасте 80 лет. Поляковой В.О. (2007) было показано, что при старении организма в сосудах тимуса возрастает экспрессия эндотелина-1, что является компенсаторным механизмом при его инволюции и способствует подержанию базового уровня продукции Т-лимфоцитов в вилочковой железе. С возрастом часть функций тимуса делегируется тимусзависимому звену периферического отдела иммунной системы. При этом усиливается периферическая экспансия Т-лимфоцитов, что вызывает снижение диапазона антиген-распознающей способности этих клеток и преобладание хелпернойсубпопуляциинад цитотоксической. Основными признаками инволюции вилочковой железы является замещение ее коркового вещества жировой и соединительной тканью, исчезновение границы между корковым и мозговым веществом, снижение количества Т-лимфоцитов, эпителиальных клеток тимуса и дендритных клеток. Несмотря на выраженность указанных инволютивных процессов, многие из них являются обратимыми.

Использование γ-излучения в моделировании старения тимуса: достоинства и недостатки

Известно, что основной мишенью действия γ-излучения в организме человека и животных являются делящиеся и дифференцирующиеся клетки, и, следовательно, органы, в которых они содержатся. В первую очередь к органам-мишеням радиоактивного воздействия относятся система кроветворения (костный мозг) и иммунная система. Среди органов иммунной системы центральным звеном воздействия γ-излучения являются тимус и Т-лимфоциты. Об особой роли тимуса в качестве мишени действия радиоактивного излучения свидетельствует способность γ-квантов изменять структуру Vβ-генов исключительно в клетках вилочковой железы. Сопоставление эффектов, вызываемых γ-излучением и инволютивных изменений в тимусе показало, что эти процессы во многом сходны. Было показано, что действие ионизирующей радиации на иммунную систему складывается из ее непосредственного влияния на Т-лимфоциты и опосредованного действия на стромальный компонент вилочковой железы. Так, через 3 недели после облучения тимуса в разовой дозе 10-25 Гр, на эпителиальных клетках ослаблялась экспрессия молекул МНС II, что вызывало снижение дифференцировки наивных Т-клеток и накопление их предшественников. Кроме того, под действием радиоактивного облучения была выявлена стимуляция дифференцировки периферических Т-клеток в сторону образования Т-хелперов. Указанные изменения могут лежать в основе старения тимуса, индуцированного радиацией. Несмотря на перспективность применения γ-излучения в качестве моделирования процессов возрастной инволюции тимуса, многие морфофункциональные аспекты соответствия такой модели истинному старению вилочковой железы еще недостаточно изучены. Вопрос о границах применения радиационного старения тимуса тем более актуален, поскольку известно, что γ-кванты оказывают крайне выраженное деструктивное воздействие на биологические объекты на всех уровнях организации. В литературе имеются данные о морфофункциональных изменения в тимусе под действием радиационного облучения. В сериях экспериментов по изучению ускоренного старения тимуса, индуцированного γ-облучением, были получены интересные данные по его воздействию на тимус. Исследование морфофункциональных изменений в тимусе под действием γ-излучения было проведено на крысах линии Вистар. В качестве источника γ-квантов использовали кобальтовый аппарат ГУБ 20000, с помощью которого проводили однократное воздействие в дозе 6 Гр (мощность дозы 200 рад/мин). Все животные были разделены на контрольную (необлученную, 6 животных) и опытную (подвергшуюся облучению, 12 животных) группу. Для гистологического исследования срезы тимуса окрашивали гематоксилин-эозином. Для оценки пролиферативной способности клеток тимуса применяли метод иммуногистохимиии с антителами к клеточному ядерному антигену PCNA (ProliferatingCellNuclearAntigen). На 8 сутки после облучения из 12 животных выжило 3 крысы, при этом у 6 животных летальный исход наступил на 3-5 сутки после воздействия в результате кишечной формы лучевой облучения. По сравнению с контрольной группой после облучения в тимусе отмечены выраженные атрофические изменения. Размеры долек тимуса значительно уменьшались, стиралась граница между корковым и мозговым веществом, тогда как у животных контрольной группы корковое и мозговое вещество вилочковой железы были четко разграничены. После действия γ-излучения площадь паренхимы железы снижалась, возрастало содержание стромального компонента. В строме тимуса наблюдался отек и выраженная жировая инфильтрация. Несмотря на сохранность популяции делящихся лимфоцитов в корковом веществе, появлялось большое количество погибших лимфоцитов, ядра которых находились в состоянии кариопикроза и кариорексиса. В тимических тельцах наблюдался распад и дегенерация клеток. В облученных тимоцитах и ретикулоэпителиальных клетках были выявлены следующие изменения, характерные для радиационного воздействия: снижение содержания органелл в цитоплазме, отек и нарушение структуры митохондрий, вакуолизация и фрагментация элементов цитоплазматического ретикулума, появление аутофаголизосом. При этом количество клеток в корковой зоне снижалось почти в 2 раза. В строме PCNA-позитивные ядра были выявлены только по периферии долек тимуса, однако в паренхиме количество пролиферирующих клеток было достаточно высоким – 33%. Сохранение пролиферативной способности клеток паренхимы вилочковой железы и увеличение в ней содержания тучных клеток указывают на возможность частичного пострадиационного восстановления тимуса. Для оценки остаточной способности клеток тимуса к регенерации на 14 и 21 сутки после облучения было проведено дополнительное исследование. В указанный период число делящихся тимоцитов не уменьшалось, но во многих клетках наблюдалось отслоение участков наружной ядерной мембраны и нарушение межклеточных контактов. Кроме того, увеличивалось количество макрофагов, содержащих крупные лизосомы. На 14 сутки после воздействия γ-излучения были отмечены изменения ультраструктуры кровеносных сосудов тимуса. В цитоплазме эндотелиоцитов наблюдалось появление вакуолей и уменьшение числа митохондрий, а ее структура выглядела отечной и уплотненной. На 21 день после облучения структурно-функциональные изменения в тимусе достоверно не отличались от тех, которые были зарегистрированы на 14 сутки. Эксперименты по влиянию радиационного излучения (суммарная доза – 6 Гр) на тимус позволили выявить необратимые структурно-функциональные изменения вилочковой железы под действием γ-квантов. Облучение приводило к снижению клеточности тимуса, особенно его корковой зоны, исчезновению границ между корковой и медуллярной зонами, диструкции его сосудистой системы. В основе указанных процессов лежат изменения внутриклеточных органоидов тимоцитов, лимфоцитов, тучных, эпителиальных клеток и эндотелиоцитов. Различные аспекты исследования γ-излучения в моделировании старения тимуса позволили выявить достоинства и недостатки данного метода. Достоинства:

1. Под действием γ-излучения, как и при истинном старении, наиболее выраженные изменения происходят в центральном звене иммунной системы – тимусе и в ее периферической части.

2. Ионизирующая радиация вызывает морфофункциональные изменения тимуса, во многом сходные с теми, что характерны для инволюции данного органа.

3. Под воздействием γ-квантов, так же как и при старении вилочковой железы, наблюдается исчезновение границы между корковым и мозговым веществом, в корковой зоне тимуса снижается количество Т-лимфоцитов, нарушается их дифференцировка, снижается количество и функциональная активность эпителиальных клеток тимуса.

Недостатки:

1. Дозы γ-излучения, применяемые для создания модели ускоренного старения тимуса, составляют от 6 до 25 Гр, что приводит к гибели большей части экспериментальных животных на 3-5 сутки после воздействия и не дает возможности длительного наблюдения, необходимой при исследовании действия различных геропротекторных препаратов.

2. Ионизирующая радиация в дозах, необходимых для моделирования инволютивных изменений в тимусе, вызывает деструкцию сосудистого русла вилочковой железы и необратимые изменения в эндотелиоцитах, что приводит к снижению ими секреции эндотелина-1. При истинном старении тимуса нарушения кровоснабжения тимуса не происходит, а вырабатываемый сосудистыми клетками эндотелин-1 играет важную роль в компенсаторных механизмах, направленных на снижение проявлений инволюции вилочковой железы.

3. γ-излучение является сильным разрушающим фактором, приводящим к множественным необратимым изменениям как на клеточном (нарушение целостности мембраны, изменение структуры ядра, появление аутофаголизосом), так и на субклеточном уровне (практически полное замещение субкапсулярной зоны тимуса соединительной и жировой тканью, резкое снижение клеточности тимуса). В то время известно, что большинство инволютивных изменений тимуса, ассоциированных с возрастом, являются обратимыми.

4. Модели ускоренного старения тимуса, созданные с использованием γ-излучения, применяются в основном для исследования эффективности препаратов, восстанавливающих функциональную активность вилочковой железы, а необратимые изменения, индуцированные ионизирующим излучением, могут нивелировать геропротекторное действие опытных лекарственных средств.

В связи с указанными недостатками примененияγ-излучения для создания моделей ускоренного старения тимуса представляется интересным рассмотреть перспективы замены ионизирующей радиации на НИЛИ, обладающее менее разрушительным действием на биологические объекты.

Воздействие НИЛИ на тимус

Воздействие НИЛИ на иммунную систему в настоящее время изучено не достаточно, а исследования по влиянию лазерного излучения на тимус не многочисленны. И.О. Бугаевой с соавторами (2003) было проведено исследование воздействия ИК лазерного излучения на тимус и лимфатические узлы у молодых крыс. Облучение лазером (длина волны 890 нм, импульсная частота 1500 Гц, время воздействия 128 с., плотность энергии на поверхности кожи животного Дж/см²). Чeрезкожное облучение проводили ежедневно в течение 10 дней в проекции зон тимуса и мезентериальных лимфатических узлов. Крысы были разделены на 7 групп: контрольную (необлученную) и 6 опытных, гистологическое исследование в которых проводили соответственно после 1, 3, 7, 15, 21 и 30 суток после лазерного воздействия. Для каждого животного вычисляли относительную массу тимуса (ОМТ = масса тимуса/масса тела) и корково-мозговой индекс (КМИ). При гистологическом исследовании подсчитывали количество корковых и мозговых тимоцитов, тучных клеток и плазмоцитов. Оценка соотношения коркового и мозгового вещества тимуса показала, что через 1 сутки после облучения КМИ достоверно снижался, на 3 сутки и после 21 суток КМИ не отличался от контроля, тогда как через 7 -15 дней после начала сеансов этот показатель возрастал. При исследовании клеточности тимуса на 1 и 3 сутки после воздействия НИЛИ так же было отменено снижение этого показателя. После облучения ИК-лазером достоверно по сравнению с контролем снижалось количество лимфоцитов корковой в зоне тимуса, уменьшалась плотность расположения тимоцитов, особенно в субкапсулярной зоне, обнаруживались единичные тучные клетки с признаками дегрануляции. На 7-15 сутки воздействия НИЛИ наблюдался обратный эффект: количество корковых лимфоцитов возрастало по сравнению с контролем, эпителиальные клетки тимуса были гипертрофированы, в некоторых отмечались фигуры митоза. Интересно отметить, что содержание тканевых базофилов в тимусе после облучения ИК-лазером возрастало с 1 по 7 сутки после облучения, однако с 7 по 15 день количество клеток было достоверно ниже контроля. Отсроченный эффект снижения количества тканевых базофилов в тимусе после облучения может указывать на опосредованное цитотоксическое влияние НИЛИ на иммунные клетки. К 30 суткам наблюдения количество тканевых базофилов в вилочковой железе восстанавливалось до контрольных значений. При исследовании воздействия ИК НИЛИ на клеточные популяции лимфатических узлов было показано, что наиболее выраженный эффект облучения приходится на малодифференцированные иммунобласты и лимфоциты в лимфоидных фолликулах. В 1 и 21 сутки количество клеток в лимфатических узлах не отличалось от контрольного, тогда как на 7, 15 сутки этот показатель значительно возрастал. Приведенные данные свидетельствуют, что НИЛИ оказывает более выраженный эффект на центральное звено иммунной системы – тимус по сравнению с ее периферической частью – лимфатическими узлами. Снижение клеточности тимуса на 1-3 сутки воздействия ИК-лазерного излучения авторы работы связывают с активацией работы стресс-реализующих систем организма, под действием усиления индуцированного облучением ПОЛ, а так же развитием общего адаптационного синдрома. Существует вероятность, что возникающая при этом стимуляция структур гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы усиливает синтез глюкокортикоидов, под воздействием которых снижается количество тимоцитов в корковом веществе вилочковой железы. Кроме того, ингибирующее действие ИК НИЛИ на начальных этапах облучения может быть связано с воздействием на ретикуроэпителиальные клетки тимуса. Дисфункция данной клеточной субпопуляции тимуса приводит к снижению синтеза важнейших тимических гормонов – тимозина-α и тимулина, недостаточность которых, в свою очередь, приводит с замедлению пролиферации тимоцитов и лимфоцитов и снижению их функциональной активности. Стимулирующее действие ИК излучения, наблюдаемое на 7-15 сутки, может быть связано с активацией антиоксидантной системы организма и другими адаптационными механизмами, возникающими в ответ на НИЛИ, выступающее в качестве стрессорного фактора. Приведенные данные показали, что ИК НИЛИ (в ежедневной разовой дозе Дж/см²) способно оказывать на тимус обратимые разнонаправленные эффекты в зависимости от времени воздействия. На 1 -3 сутки воздействия ИК-излучение вызывало инволютивные изменения тимуса. Указанное воздействие выражалось в снижении клеточности вилочковой железы, в особенности ее коркового вещества, и дегрануляции тучных клеток. При увеличении времени воздействия до 10 суток и в течение 5-10 дней после его прекращения наблюдался обратный эффект: клеточность тимуса (за исключением тканевых базофилов) возрастала, увеличивалась митотическая активность эпителиальных клеток тимуса. Кроме того, при увеличении времени воздействия до 10 суток усиливается пролиферация клеток в лимфатических узлах, тогда как на 1 -3 сутки облучения данный эффект отсутствует. Описанные результаты свидетельствуют, что при использовании ИК НИЛИ с указанными параметрами в качестве модели ускоренного старения целесообразно исследовать морфологические изменения тимуса на 1-3 сутки воздействия, когда излучение угнетает функциональную активность вилочковой железы, тогда как дальнейшее облучение приводит к усилению репаративных процессов в тимусе. Несмотря на небольшое количество данных по взаимодействию НИЛИ с тканью тимуса и периферическим звеном иммунной системы, можно выделить следующие достоинства при использовании лазерного излучения низкой интенсивности в сравнении с γ-излучением для создания моделей ускоренного старения тимуса:

1. Изменения, оказываемые НИЛИ на клетки тимуса, носят обратимый характер, что подтверждается полным восстановлением структуры и функциональной активности вилочковой железы через месяц после воздействия.

2. Снижение функциональной активности клеток корковой зоны тимуса под действием НИЛИ в основном связано с его ингибирующим действием на ТЭК, что является одним из основных признаков, характерных для истинной инволюции вилочковой железы.

3. При использовании НИЛИ для моделирования ускоренной инволюции тимуса возможно применение широкого диапазона доз – от минимальной, описанной в литературе - Дж/см^{2 -} до пограничной, между низко- и высокоинтенсивным лазерным излучением и длин волн, а так же времени воздействия. При этом даже максимальные дозы НИЛИ в большинстве случаев обеспечивают высокую выживаемость подопытных животных, что позволяет отслеживать результаты экспериментов в течение длительного времени.

Инволюция тимуса является одним из центральных механизмов старения, а восстановление его функциональной активности – важной задачей геронтологии. Для изучения свойств геропротекторных препаратов используют модель ускоренного старения тимуса, создаваемую с помощью γ-излучения. Применение γ-излучения в создании модели ускоренного старения тимуса имеет ряд существенных недостатков, связанных с выраженным разрушающим действием ионизирующего излучения на вилочковую железу, под действием которого в ней происходят необратимые изменения. Для создания более адекватной модели ускоренного старения перспективно применение НИЛИ, действие которого не вызывает необратимых изменений в тимусе, но во многом аналогично γ-излучению.

3.2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения
на сердечно-сосудистую систему