Формирование лунок и канавок в геле

При помощи штампов в слое геля вырезают лунки для антигенов и канавки для антисывороток. Выбор подходящего штампа определяется задачей исследования. Очень удобны штампы с изменяемым профилем. Вырезанные фрагменты геля удаляют иглой или при помощи водоструйного насоса. В образовавшиеся лунки вносят примерно по 2 мкл исследуемого материала микрошприцем. Полоски геля, образовавшиеся после вырезания канавок, также следует удалить до электрофореза, так как после это будет трудно сделать вследствие нагревания геля. Вырезанные фрагменты геля удаляются гораздо легче, если пластинки на 1—2 мин поместить в морозильник.

Проведение электрофореза

Электрофоретическую камеру присоединяют к источнику постоянного тока, выдерживающего нагрузку до 100 мА. Электродные отсеки заполняют веронал-ацетатным буфером с рН 8,6 и устанавливают камеру строго горизонтально по уровню.

Внесение антисыворотки

После электрофоретического разделения белков в продольную канавку вносят 0,03—0,05 мл преципитирующей иммунной сыворотки. Сыворотка не должна переливаться через край канавки, иначе расположение линий преципитации будет искажено.

Иммунодиффузия, элюирование, окрашивание

Иммунодиффузия продолжается не менее 24 ч во влажной камере.

Затем сразу же начинают элюировать белки, которые не участвовали в преципитации, с помощью 0,15 М NaCl. Элюирование проводят 3 сут с ежедневной сменой раствора. После этого пластины геля накрывают фильтровальной бумагой (не оставляя пузырьков воздуха) и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40 °С. Для окрашивания белков чаще всего применяют амидо черный 10 В, лиссаминовый (светлый) зеленый, азокармин В или пунцовый 2R. Липопротеиды окрашивают су-даном черным В. При этом важно окрашивать полностью высушенный препарат, так как судан черный В нерастворим в воде и не воспринимается влажным гелем или образует неспецифические осадки. Иммунофореграмма белков сыворотки человека, проявленная полиспецифической антисывороткой кролика, представлена на рисунке.

Гели и их свойства.

Основная функция геля — локализация преципитата. Она становится возможной, если растворенные антигены и антитела легко диффундируют в геле, но образующиеся иммунные комплексы ввиду их величины остаются внутри ячеек геля. Благодаря локализации преципитата достигается следующее:

а. В множественных системах антиген-антитело отдельные компоненты реакции диффундируют с различной скоростью, обусловленной неодинаковой величиной молекул и их концентрацией. В связи с этим могут образовываться множественные пространственно разделенные преципитаты, т. е. создается возможность анализа множественных систем.

б. По форме и расположению преципитатов можно судить о диффузионных свойствах и, следовательно, об относительной молекулярной массе антигена или антитела.

в. Порядок расположения линий преципитации по отношению друг к другу позволяет делать выводы об полном или частичном иммунохимическом сходстве, а также об отсутствии такового.

г. Исходя из величины ареала и удаленности от линии старта иммунных комплексов, можно проводить их количественное определение.

 

Наиболее распространены гели агара и агарозы; гели желатины, пектина, крахмала, полиакриламида или ацетата целлюлозы применяются в реакциях иммунодиффузии реже.