Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Иммуноферментный и радиоиммунный
АНАЛИЗЫ В основе самых распространенных на сегодня методов иммуноанализов, базирующихся на количественном определении растворимых веществ, лежит взаимодействие антигена с антителом (т.е. иммунологическое распознавание), которое детектируется (визуализуется) с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с антителом, либо с антигеном. В качестве меток используют вещества, которые при определенных условиях тот или иной прибор может «увидеть» (зарегистрировать) и измерить количество метки. Физико-химическая чувствительность таких анализов обычно составляет нанограммы на миллиметр, но, применяя конкретные тест-системы, нередко выявляют пико- и фемтомоли определяемого вещества. Варианты меток и материалов для твердой фазы Метки 1. Радионуклид используется при радиоиммунном анализе (РИА). 2. Ферменты, катализирующие превращение бесцветного субстрата в цветной или флюоресцирующий продукт. В данном случае исследование называют иммуноферментным анализом (ИФА), его разновидность - анализ иммуноферментно-флюоресцентный. 3. Флюоресцирующие, люминесцирующие вещества и др. В случае РИА результат измеряют на счетчиках радиоактивности в зависимости от того, какие частицы/кванты излучает конкретная метка-радионуклид. Результаты РИА нельзя зарегистрировать без соответствующих приборов. В случае ИФА при образовании цветного продукта результат реакции определяют с помощью спектрофотометра, измеряющего оптическую плотность. Без прибора, на глаз, реакцию можно оценить приблизительно как положительную или отрицательную. При использовании в качестве метки фермента, катализирующего образование флюоресцирующего продукта, результат реакции определяют на флюориметре, измеряющем излучение в определенном диапазоне длин волн. Без прибора в данном случае не обойтись. Впервые методы РИА были разработаны в 1958 г. С. Берсоном и Р. Ялоу. Последняя удостоена в 1977 г. Нобелевской премии за РИА, позволившего впервые в мире определять нанограммовые концентрации пептидных гормонов в крови человека. Менее чем через год после описания РИА в качестве метки стали использовать ферменты с бесцветными субстратами, но окрашенными продуктами. Метод назвали ИФА. По чувствительности и специфичности РИА и ИФА одинаковы, так как их показатели определяются в большей мере аффинностью взаимодействия антитела и антигена, а не типом метки. Однако ИФА применяют много чаще, чем РИА, ибо реагенты для ИФА существенно дольше остаются стабильными, а следовательно, технологию ИФА проще стандартизировать. В РИА используют непрерывно излучающие радионуклиды, и величина их удельной радиоактивности непрерывно же изменяется. Для мечения белков применяют радионуклиды йода (131I или 125I; γ-излучение), у которых период полураспада весьма короток, и реагенты необходимо обновлять примерно раз в месяц.
Сначала иммуноанализы разрабатывали в так называемых гомогенных вариантах (без разделения компонентов в растворе). Но вскоре в технологии иммуноанализов начали использовать твердую фазу, на которой методом спонтанной сорбции из раствора фиксируется антиген или антитело. Анализы стали называть твердофазными, или иммуносорбентными (англ. ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay). Технологически твердофазные анализы несравнимо удобнее гомогенных тестов. В настоящее время твердофазные варианты ИФА применяют в 99,9% тест-систем. В качестве «твердой фазы» используют следующие материалы: 1) пластмассу (полистирол, поливинилхлорид и др.) в виде стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60 лунками (или шарики, колпачки и прочее - для постановки единичных проб); 2) пористые материалы типа нитроцеллюлозы в виде наполнителей в объеме или в виде плоских листов или полосок стрипов (англ. strip); стрипы используют в методиках типа иммуноблота и иммунохроматографии; в пористых материалах существенно больше площадь, на которой сорбирован один из участников взаимодействия; другие реагенты диффундируют по порам. Принцип иммуносорбентных анализов заключается в том, что на материале твердой фазы в соответствии с физико-химическими свойствами сорбируется антиген или антитело. Белки хорошо сорбируются на подобранных для ИФА/РИА пластмассовых материалах. Если заданный антиген в силу своей химической природы (липид, углевод, липоили гликопроизводные белков) плохо сорбируется на выбранной твердой фазе, то подбирают вещество-«подложку», которое с одной стороны хорошо свяжется с твердой фазой, с другой стороны - с антигеном. Однако потребность в «подложке» возникает крайне редко.
Все остальные реагенты тест-систем используют в виде растворов. Их добавляют к твердой фазе поочередно, инкубируют, после чего несвязавшиеся реагенты легко удаляют промывкой твердой фазы. В этом главное технологическое преимущество твердофазного иммуноанализа. Результат реакции «остается» на твердой фазе и регистрируется количественно. Существует много вариантов конструкций тест-систем для иммуноанализов. Мы разберем несколько базисных и более подробно объясним значения терминов. Прямые иммуноанализы Прямыми называют анализы, в которых метку присоединяют непосредственно либо к заданному антигену, либо к антителу, специфичному против искомого антигена. Прямой вариант используют в гомогенных системах и некоторых гетерогенных: в конкурентном, ингибиторном, сэндвич-ИФА и иммуноферменто-метрическом анализе (рис. 4.5).
|
|||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-02-10; просмотров: 172; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.224.63.87 (0.007 с.) |