Тема 5. Реакція зв’язування комплементу (рзк)

Ця серологічна реакція основана на властивості комплексу антиген-антитіло фіксувати вільний комплемент. Вперше описана в 1910 році бельгійськими бактеріологами Борде та Жангу.

В основі реакції лежать два явища – бактеріоліз та гемоліз. У прояві цих явищ бере участь комплемент, тобто творення комплексу антиген-антитіло відбувається тільки у присутності комплементу. Реакція утворення комплексу антиген – антитіло – комплемент невидима. Щоб виявити утворення комплексу, використовують додаткову індикаторну систему, яка відображає, що відбулося в першій фазі реакції. Таким чином, РЗК проходить у дві фази, або системи:

1) бактеріолітична (основна-діагностична), яка складається з досліджуваної сироватки (антитіло), антигену та комплементу;

2) гемолітична (допоміжна-індикаторна), складається з гемолізину та еритроцитів барана, яка дозволяє встановити чи утворився комплекс і зв’язався комплемент в першій системі.

Раніше в ролі антигену використовували суспензію бактерій і в позитивних випадках проходив їх лізис (бактеріоліз), тому перша система отримала назву бактеріолітичної. У другій системі відбувається або затримується гемоліз еритроцитів.

Гемолізин це антитіло по відношенню до еритроцитів барана. Еритроцити барана – антиген для гемолізину.

Якщо досліджувана сироватка бактеріолітичної системи містить антитіла гомологічні антигену, відбувається утворення комплексу антиген-антитіло, і комплемент зв’язується (фіксується) на ньому. В цьому випадку при додаванні гемолітичної системи не буде гемолізу, тому що без комплементу гемолізин не зможе лізувати еритроцити. Результат реакції позитивний (тварина хвора, або перехворіла).

Якщо ж у досліджуваній сироватці немає антитіл, специфічних до взятого антигену, комплекс антиген-антитіло не утвориться у першій бактеріолітичній системі, комплемент не адсорбується (не зв’язується), залишається у пробірці вільним, і при додаванні другої (гемолітичної) системи комплемент взаємодіє з комплексом гемолізин (антитіло)-еритроцити (антиген) і відбувається гемоліз (лізис). Діагностичний результат негативний (тварина здорова). Таким чином, в РЗК приймають участь 5 компонентів: антиген, антитіло (досліджувані та контрольні сироватки), комплемент, гемолізин, суспензія еритроцитів барана (рис. 12).

 

 

А н т и г е н и для РЗК готують на біофабриках. Найчастіше це екстракти з зруйнованих бактерій, інфікованих ними тканин, завісь убитих бактерій, що не мають гемолізуючої дії. На упаковці антигену зазначено номер серії, контроль, дату виготовлення, строк придатності, активність, тобто у якому розведенні його слід використовувати при постановці реакції 1:100, 1:50 і т. д.

С и р о в а т к и. В РЗК використовують сироватки, що надійшли для дослідження та контрольні: позитивні (специфічні), що містять антитіла до антигену. Вони отримані гіперімунізацією тварин збудником (антигеном); нормальні (негативні), отримані від здорових тварин і не містять специфічних антитіл. Перед постановкою реакції їх розводять фізрозчином 1:5 або 1:10, щоб не відбулось коагуляції, інактивують у водяній бані 30 хв при 63°С – кролів та собак; 56–58°С – великої рогатої худоби; 58–60°С – коней та овець; 63–65°С – ослів та мулів. Інактивують (прогрівають) сироватки з метою руйнування власного комплементу.

Е р и т р о ц и т и б а р а н а є антигеном в гемсистемі. Кров беруть у дорослих баранів з яремної вени у колбу (флакон) з скляними намистинами (кульками) і невеликою кількістю фізрозчину. Кров струшують обережними круговими рухами, фібрин осідає на кульках. Рідку частину крові центрифугують, надосадкову рідину зливають. Еритроцити відмивають від сироватки фізрозчином шляхом 3-4 кратного центрифугування. Надосадкова рідина повинна бути прозорою і безколірною, потім її видаляють, а осад розводять фізрозчином 1:40.

Г е м о л і з и н є антитілом в гемсистемі. Готують його на біофабриках шляхом гіперімунізації кролів відмитими еритроцитами барана: кролям внутрішньовенно вводять 4–5 разів з 2–3 денним інтервалом 40% суспензію відмитих еритроцитів. Через неділю після останньої ін’єкції у кролів беруть кров, отримують сироватку, інактивують її і консервують гліцерином 1:1, титрують і розливають в ампули. В лабораторіях перед постановкою РЗК гемолізин знову титрують, тому що активність його з часом знижується, тобто визначають найменшу кількість гемолізину, або найбільше розведення яке у присутності комплементу викликає повний гемоліз еритроцитів.

К о м п л е м е н т – складова частина свіжої сироватки крові, лімфи, тканинних рідин теплокровних тварин і людини. В РЗК використовують сироватки крові морської свинки як найбільш чутливий комплемент. Комплемент має білкову природу складної структури, швидко інактивується при нагріванні, довготривалому зберіганні, струшуванні, під дією ультрафіолетових променів, хімічних речовин (кислоти, луги, ацетон, хлороформ тощо).

На даний час біопромисловість випускає комплемент консервований висушуванням в умовах вакууму при низьких температурах (ліофілізація). Висушений, потім запаяний в ампулах комплемент зберігається два роки. Перед кожною постановкою РЗК комплемент титрують, перевіряють його активність тобто визначають дозу, яку необхідно взяти в реакцію. Вона повинна бути такою, щоб повністю зв’язалась комплексом антиген-антитіло. Якщо якась частина комплементу залишиться не зв’язаною, то при додаванні гемолітичної сироватки й еритроцитів, останні будуть лізуватись. А наявність гемолізу, як відомо, свідчить про негативний результат РЗК. Ось чому так важливо визначити титр комплементу. Титром комплементу буде та його найменша кількість при якій спостерігається повний гемоліз еритроцитів.

 

Реакція тривалого зв’язування комплементу (РТЗК )

Ця реакція вважається більш ефективніша по чутливості у порівнянні з класичною методикою РЗК, а саме, дає можливість виявити мінімальну кількість антитіл та антигену. Суть методики полягає у тому, що бактеріолітичну систему витримують у трьох температурних режимах: після змішування компонентів – при кімнатній температурі протягом 15 хв, при температурі 4°С (у холодильнику) протягом 12–18год, після чого підігрівають 15 хв у водяній бані (37°С) і вносять гемолітичну систему. Залишають, як і при постановці РЗК, у водяній бані і враховують результати реакції.

РТЗК рекомендовано для діагностики бруцельозу, кампілобактеріозу, туберкульозу.

Питання для самоконтролю:

1. Суть реакції зв’язування комплементу.

2. Призначення компонентів РЗК та їх отримання.

3. Відмінність РЗК від РТЗК.

 

 

Тема 6. Реакція імунофлуоресценції (РІФ) або метод флуоресцуючих антитіл (МФА)

Індикація бактеріальних і вірусних антигенів у інфікованих матеріалах, тканинах тварин та клітинних культурах за допомогою флуоресциюючих антитіл (сироваток) набула значного поширення в діагностичній практиці. Імунофлуоресцентний метод належить до методів експрес-діагностики. За чутливістю і специфічністю він не поступається іншим серологічним реакціям.

Названа реакція запропонована і розроблена Кунсом в 1942 році. Автор реакції з’єднав антитіла імунної сироватки з флуорохромом, внаслідок чого вони почали світитися (флуоресціювати) в люмінісцентному мікроскопі під дією ультрафіолетових променів. Таку сироватку назвали міченою. Кращим флуорохромом вважають флуоресцеїн ізотіоціонат (ФІТЦ). Флуорохром у певній кількості вносять у сироватку, де він адсорбується на молекулах антитіл. Мічену сироватку очищають від неімунних білків і зайвого флуорохрому фільтрацією через сефадекс. При нанесенні на фіксований мікробний препарат міченої сироватки, антитіла адсорбуються на специфічних (гомологічних) мікробних об’єктах (антигенах), міцно з ними зв’язуються і тоді останні світяться в люмінісцентному мікроскопі жовто-зеленим кольором. Якщо антиген (гетерологічний) не відповідає міченим антитілам, що знаходяться у сироватці, то останні легко видаляються при промиванні препарату.

РІФ має переваги перед РА, РП, РЗК. По-перше, дає змогу ідентифікувати мікроби не лише в чистій культурі, а і у змішаній і в мазках-відбитках з патологічного матеріалу, гістозрізах з уражених тканин, а також у препаратах з інфікованих курячих ембріонів. По-друге, за її допомогою можна вивчати морфологію мікробних об’єктів (бактерій, мікоплазм, рикетсій). По-третє, не потребує у діагностиці багато часу, тобто є експрес-методом.

Розрізняють три модифікації реакції імунофоуоресценції: прямий, непрямий двоетапний і непрямий триетапний. Найчастіше застосовують два перші варіанти.

П р я м и й в а р і а н т (рис. 13а). Для ідентифікування збудника інфекції на предметному склі готують мазки - відбитки з виділеної культури або патологічного матеріалу. Препарат з нанесеним матеріалом підсушують на повітрі і фіксують у ацетоні від 5 до 50 хв краще при температурі мінус 20°С. На предметне скло з зафіксованим антигеном наносять люмінісцуючу імунну сироватку, що містить антитіла до антигену, що діагностують. Препарат поміщають у вологу камеру (чашку Петрі) з фільтрувальним папером, змоченим водою і витримують у термостаті при 37–38°С протягом 15–30 хв, або при кімнатній температурі в темному місці 40–50 хв. Потім препарат промивають у проточній воді 5–10 хв від залишку білків, що не зв’язались, рН не нижче 7,0.

Промитий препарат висушують фільтровальним папером, наносять диметилфталат (нелюмінісцуючу імерсійну олію) і розглядають у люмінісцентному мікроскопі. Якщо у препараті є мікроби, специфічні щодо антитіл сироватки, то вони яскраво світяться на темному фоні мікроскопа. Цим методом користуються лише для ідентифікації невідомого антигену. Недоліком його є необхідність приготування люмінісцуючої сироватки для кожного виду ідентифікованого мікроорганізма.

Н е п р я м и й в а р і а н т РІФ (рис. 13б). Порівняно з описаним вище методом цей універсальніший, тому що за допомогою однієї універсальної міченої сироватки можна виявити різні види мікроорганізмів.

Метод двоетапний. На першому етапі на фіксований препарат наносять краплю імунної, не міченої сироватки специфічної до передбачуваного антигену, і ставлять у термостат на 15–20 хв. Потім промивають водою. Антитіла, які відповідають антигену, що є у препараті, не відмиваються.

На другому етапі на препарат наносять краплю антивидової люмінісцуючої сироватки, що містить антитіла проти глобулінів першої сироватки, і знову поміщають у термостат в умовах вологої камери на 15–20 хв. Після цього препарат промивають, висушують і мікроскопують.

Антивидова сироватка – це мічені флюорохромом антитіла проти глобулінів крові тих тварин, від яких одержано імунну сироватку до передбачуваного антигену. Таким чином, антитіла першої (не міченої, специфічної) сироватки є антигеном для мічених антитіл антивидової сироватки. В результаті до комплексу антиген – антитіло, що утворився на першому етапі реакції, приєднуються антитіла антивидової сироватки, тобто утворився подвійний комплекс, який можна виявити за допомогою люмінісцентного мікроскопа (рис. 14).

Антивидові сироватки отримують імунізацією глобулінами тварин тих видів, від яких отримували специфічні сироватки.

 

 

 

 

Питання для самоконтролю:

1. Суть реакції імунофлуоресценції.

2. Методика постановки прямого методу РІФ та врахування результатів реакції.

3. Суть та методика постановки непрямого (двоступеневого) методу РІФ.