Семинар 4. Питательные среды.

Культивирование микроорганизмов является одним из основных методов микробиологии. От умения культивировать микроорганизмы в лабораторных условиях в значительной степени зависят успехи их изучения и практического применения. Культивирование основано на знании метаболизма микроорга­низмов и понимании значения физико-химических условий среды, необходи­мых для их жизнедеятельности.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Потребности микроорганизмов в питательных веществах чрезвычайно раз­нообразны и определяются особенностями их метаболизма. Во-первых, пита­тельная среда должна включать доступный для клетки источник энергии. Для одних организмов (фототрофов) таким источником служит свет, для других — органический (хемоорганотрофы) или неорганический (хемолитотрофы) суб­страт. Во-вторых, среда должна содержать все необходимые компоненты для реализации конструктивных процессов в клетке, причем синтетические способ­ности микроорганизмов могут варьировать от использования СО₂ в качестве единственного источника углерода (автотрофы) до потребности в более вос­становленных соединениях углерода — кислотах, спиртах, углеводах и др. (гетеротрофы). Последние чаще всего получают и углерод, и энергию, метаболизируя одно и то же органическое соединение, т.е., строго говоря, являются хемоорганогетеротрофами.

По способности использовать те или иные источники азота микроорганиз­мы также существенно отличаются друг от друга. Одни из них довольствуются молекулярным азотом воздуха и не требуют добавления в среду каких-либо азотсодержащих соединений. Другие требуют присутствия в среде неоргани­ческих солей азота. Третьим нужна одна или несколько аминокислот. Отдель­ные аминокислоты в L- или DL-форме добавляют к стерильной среде в кон­центрации от 0,1 до 0,05 г на 100 мл непосредственно перед засевом ее микро­организмами. Для этого рекомендуется использовать растворы аминокислот, в которых концентрация превышает содержание аминокислоты в среде в 100 раз. Глицин, аланин, пролин, лизин и орнитин растворяют в дистиллированной воде, фенилаланин и триптофан — в дистиллированной воде, подщелоченной NаОН, остальные аминокислоты - в дистиллированной воде, подкислен­ной НС1. Аминокислоты — цистин и цистеин, а также амиды — глутамин и аспарагин неустойчивы к нагреванию, поэтому их стерилизуют фильтрованием. Остальные аминокислоты можно стерилизовать при 0,5 атм в течение 15 мин.

Потребности микроорганизмов в некоторых аминокислотах часто удовлет­воряют, добавляя к среде гидролизат белка. Состав гидролизатов неодинаков и зависит от исходного субстрата, а также способа получения. Чаще других ис­пользуют гидролизат казеина, который готовят в лаборатории, как правило, кислотным гидролизом, еще чаще используют готовый препарат гидролизата казеина или готовят его в лаборатории. Его вносят в среду от 1,0 до 0,1 г на 100 мл в зависимости от потребности микроорганизмов.

Наиболее требовательные организмы культивируют на средах, содержащих белки или продукты их неполного расщепления — пептоны, представляющие собой смесь поли- и олигопептидов, аминокислот, органических азотных ос­нований, солей и микроэлементов. Пептоны получают в результате воздей­ствия протеолитических ферментов на белки животного или растительного происхождения. В питательные среды пептон добавляют в количестве от 1 — 2 до 20 г на 1 л.

Необходимо иметь в виду, что аминокислоты и пептон могут использовать­ся микроорганизмами не только как источник азота, но и как источник угле­рода и энергии.

Многие микроорганизмы требуют наличия в среде так называемых факто­ров роста, к которым относятся пурины, пиримидины и аминокислоты. Чтобы подчеркнуть потребность микроорганизмов в факторах роста, принято исполь­зовать термины «прототрофы» и «ауксотрофы». Прототрофы не нуждаются в факторах роста, для ауксотрофов абсолютно необходимо наличие в среде од­ного или нескольких факторов роста. Этим термином особенно широко пользу­ются в литературе по генетике. Если потребности микроорганизмов в факторах роста ограничены одним или несколькими витаминами, то рекомендуется вно­сить их в культуральные среды, используя следующие концентрации: тиамин (витамин В₁), пантотенат Са, рибофлавин (витамин В₂), никотиновая кислота (ниацин), пиридоксин, пиридоксамин, холин, кобаламин (витамин В₁₂) - по 1 мкг на 1 мл среды; фолиевая кислота и пара-аминобензойная кислота - 0,05 мкг на 1 мл среды; биотин — 0,005 мкг на 1 мл среды.

Витамины добавляют к стерильной среде непосредственно перед ее засевом. Для этого рекомендуется использовать растворы, в которых концентрация ви­тамина превышает его содержание в среде в 100 раз. Растворы готовят в сте­рильной посуде и используют стерильную дистиллированную воду. Исключе­ние составляют рибофлавин и фолиевая кислота. Рибофлавин растворяют в 0,02 н. уксусной кислоте, а фолиевую кислоту — в 0,01 н. NаОН, доводя затем концентрацию NаОН в растворе до 0,001 н. Полученные растворы стерилизуют прогреванием в кипящей водяной бане 3 мин. Раствор тиамина рекомендуется стерилизовать фильтрованием, так как при нагревании тиамин разрушается. При температуре 4 °С растворы витаминов сохраняются не менее месяца. Растворы фолиевой кислоты, пиридоксина и рибофлавина хранят в темноте, так как они чувствительны к свету.

Примерами смесей, содержащих различные факторы роста, могут служить дрожжевой экстракт, дрожжевой автолизат, а также кукурузный экстракт. Дрож­жевой экстракт вносят в среду для культивирования от 0,05 до 0,5 г на 100 мл, дрожжевой автолизат — в таком количестве, чтобы концентрация аминного азота составляла 5 — 30 мг на 100 мл среды. Дрожжевой экстракт имеется в продаже. Дрожжевой автолизат легко приготовить в лабораторных условиях.

Кукурузный экстракт — готовый продукт заводов крахмалопаточной про­мышленности. Он содержит аминокислоты, витамины, большое количество органических кислот (молочной, уксусной и муравьиной) и минеральные соли. Кукурузный экстракт вносят в среды в количестве от 0,2 до 5%; стерилизуют при 0,5 атм.

Для построения вещества клетки микроорганизмам необходимы фосфор, сера, калий и ряд других элементов. Они должны содержаться в питательной среде в доступной для микроорганизмов форме. Потребности разных групп микроорганизмов в сере, фосфоре и других зольных элементах удовлетворяют­ся обычно за счет минеральных солей. Поэтому «минеральный фон» сред для культивирования многих микроорганизмов может быть близким по составу. Так, потребности значительного числа микроорганизмов в сере удовлетворяются сульфатами, хотя в клетке сера находится в основном в восстановленной форме, в виде сульфгидрильных групп. Значительно реже встречаются микроорга­низмы, требующие наличия в среде восстановленной серы. В этом случае в среду вносят сульфиды, чаще всего Н₂S или органические соединения, со­держащие сульфгидрильные группы, например цистеин.

Соли фосфорной кислоты удовлетворяют потребности микроорганизмов в фосфоре.

Микроорганизмы все необходимые металлы - К, Nа, Са, Мg, Fе, Мn, Со, Сu — и другие элементы получают в форме катионов или анионов неорганических солей. Например, источником магния служит МgSО₄, источником натрия и хлора — NаС1, кальция — СаСО₃ или СаС1₂. Железо вносят в среды в виде хлорида, сульфата или цитрата.

Чтобы избежать выпадения осадка в результате образования нерастворимых комплексов фосфатов с некоторыми катионами, особенно с железом или каль­цием, к средам рекомендуется добавлять от 0,001 до 1 г/л этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) или гексаметафосфата натрия в концентрации 4 г/л. Комплек­сы, образуемые этими соединениями с катионами, служат резервом, из кото­рого в результате диссоциации поступают свободные катионы.

Калий, магний, кальций и железо требуются в относительно больших ко­личествах, поэтому их соли, как правило, включаются в состав питательных сред. Потребности микроорганизмов в марганце, молибдене, цинке, меде, кобальте и др. очень малы. Эти элементы часто называют микроэлементами, их вносят в среды строго определенного состава, приготовленные на дистилли­рованной воде в количестве от 1 мг до 1 мкг на 1 л. Об оптимальных концен­трациях микроэлементов для разных микроорганизмов известно мало, поэто­му предложены различные по составу смеси микроэлементов. Растворы микроэлементов рекомендуется стерилизовать отдельно и вносить в среду непосред­ственно перед посевом. Среды, приготовленные на водопроводной воде, а так­же среды, включающие натуральные компоненты, содержат необходимые микроэлементы и не требуют их специального добавления.

По составу среды для культивирования микроорганизмов делят на нату­ральные (естественные) и синтетические. К натуральным относятся среды, со­стоящие из продуктов животного или растительного происхождения: овощные или фруктовые соки, молоко, животные ткани, разведенная кровь, вода мо­рей, озер, минеральных источников, а также отвары или экстракты, получен­ные из природных субстратов — мяса, рыбы, дрожжей, растений, круп, наво­за и почвы. К натуральным относятся также и так называемые полусинтетические среды, состоящие из природных продуктов в комбинации с рядом опре­деленных химических соединений. Натуральные среды богаты органическими веществами, однако имеют сложный и непостоянный состав, поэтому они малопригодны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Синтети­ческие среды представляют собой комплекс определенных химически чистых соединений, взятых в точно указанных концентрациях. Синтетические среды наиболее удобны для изучения метаболизма микроорганизмов. Состав синте­тических сред может варьировать настолько широко, насколько широко изме­няются пищевые потребности культивируемых на них микроорганизмов. В за­висимости от задачи исследования синтетические среды готовят на водопро­водной или дистиллированной воде. Синтетические среды могут иметь доволь­но большой набор компонентов (включая микроэлементы), но могут быть и относительно простыми по составу. Рецепты некоторых синтетических сред и способы приготовления натуральных приведены в приложении 4.

По назначению среды подразделяют на элективные и дифференциально-ди­агностические (индикаторные). Элективные среды обеспечивают преимуществен­ное развитие одного вида или группы микроорганизмов и менее пригодны или даже совсем не пригодны для развития других. Элективные среды применяют главным образом на первом этапе выделения микроорганизмов из естествен­ных субстратов, т.е. для получения накопительных культур (например, среда Эшби является элективной для рода Azotobacter).

Дифференциально-диагностические среды дают возможность быстро отличить одни виды микроорганизмов от других или выявить некоторые их особенности. Примером индикаторной среды для выявления бактерий из группы кишечной палочки в естественных субстратах может служить агаризованная среда Эндо. Бактерии рода Escherichia на этой среде образуют малиновые колонии с металлическим блеском. При определении видовой принадлежности бактерий часто используют рН-индикаторные среды в состав которых входит один из индикаторов – нейтральный красный (0,0005%), феноловый красный (0,005%) или бромтимоловый синий (0,0005%). Если развитие микроорганизма сопровождается образованием кислоты или щелочи, цвет индикатора меняется. Индикаторные среды особенно часто применяются в санитарной и медицинской микробиологии.

По физическому состоянию среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми (плотными) и сыпучими. Жидкие среды широко применяют для выявления физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, накопления биомассы или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах. Полужидкие среды получают добавлением к жидким средам 0,5 % агара и используют для специальных це­лей, например культивирования анаэробных микроорганизмов. Сыпучие (су­хие) питательные среды приобретают все большее практическое значение. Стан­дартность, простота хранения, транспортировки и изготовления делают их весьма удобными для работы. В микробиологическом производстве используются разва­ренное пшено, отруби. В клинической микробиологии нашли применение диф­ференциально-диагностические среды — среда Эндо, сухая желчь, среда Леффлера и т.д. Они представляют собой светло-желтые гигроскопичные порошки без комков с влажностью до 10 %. В сухом месте в хорошо закупоренной посуде их можно хранить длительное время. Они хорошо растворяются в воде при ком­натной температуре в концентрации 1,5 — 6,0%. Плотные среды используют в микробиологической практике со времен Р. Коха. Они необходимы для выделе­ния чистых культур микроорганизмов, в диагностических целях, для количе­ственного учета микроорганизмов, хранения культур и в ряде других случаев. Уплотняющими агентами являются агар, желатин, силикагель.

Агар используют для уплотнения особенно часто. Он представляет собой сложный полисахарид, в состав которого входят агароза и агаропектин. Кроме того, агар вклю­чает небольшое количество легкоассимилируемых веществ и различные соли. Агар по­лучают из некоторых морских водорослей и выпускают в виде стебельков, пластин или порошка. Агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата для роста. В воде он образует гель, который плавится примерно при 100°С и затвердевает при температуре около 45 °С, поэтому на агаризованных средах можно культивировать значительную часть известных микроорганизмов. Чаще всего агар добавляют к средам в количестве 2 %, реже — 1,5 (более влажная среда) или 3 % (более сухая среда). Необходимо учитывать, что агар сохраняет свои свойства только при рН, близком к нейтральному. Агар всегда содержит органические и неорганиче­ские примеси, поэтому для приготовления сред строго определенного состава агар предварительно очищают, «выщелачивают». Экстракцию примесей проводят в течение 2 — 3 нед водопроводной водой при 30 — 37 °С со сменой воды через 1 — 2 сут. Проце­дуру прекращают, когда вода перестанет мутнеть. «Выщелоченный» агар помещают в двойной марлевый мешок и 2 — 3 сут промывают в проточной водопроводной воде. Затем агар высушивают и используют в количестве 1,5 — 2,0% (табл. 3.1).

Желатин — белок, получаемый из костей, хрящей и кожи животных. Образуемый им гель плавится при температуре 24 — 26 °С, которая ниже обычной температуры ин­кубации многих микроорганизмов (30 — 37 °С). К тому же многие микроорганизмы об­разуют протеолитические ферменты, разлагающие желатин. Поэтому желатин глав­ным образом используют для определения протеолитической активности микроорга­низмов с целью их идентификации (табл. 3.1).

Кремнекислый гель (силикагелъ) применяют как твердую основу для синтетических сред строго определенного состава, поскольку он является веществом неорганической природы. Для получения силикагеля к соляной кислоте (плотность 1,1) добавляют при перемешивании равный объем жидкого стекла (раствор Na₂SiO₃ или К₂SiO₃ той же плотности). Смесь разливают по чашкам Петри по 25 — 30 мл в каждую и оставляют в покое для образования геля. Затем чашки помещают в стеклянный сосуд и промывают гель проточной водой для удаления хлоридов. Наличие хлоридов проверяют качествен­ной реакцией с AgNO₃. Завершают процедуру промыванием силикагеля горячей дис­тиллированной водой (табл. 3.1).

В качестве уплотняющего средства в микробиологическую практику входит каррагинан — подобный агару полисахарид, экстрагируемый из красных водорослей. Каррагинан не используется большинством видов микроорганизмов. Для получения устойчивого при 45 и 60 °С геля используют соответственно 2,0 и 2,4 % каррагинана.

 

Таблица 3.1 Основные характеристики веществ, употребляемых для уплотнения питательных сред

Характеристика	Агар	Желатин	Кремнекислый гель
Исходный материал для получения	Морские водоросли	Кожа, кости, хрящи	Кремнекислый калий или натрий и соляная кислота
Основные компоненты	Полисахариды	Белки	Кремневая кислота
Температура плавления, "С	* 100	22-25	—
Температура застывания, °С	«45	22-25	—
Действие протеаз	Не действуют	Действуют	Не действуют
Конденсационная вода	Выделяется	Не выделяется	Не выделяется
Употребляемая концентрация, %	1,0-3,0	10-20	—

Для некоторых специальных исследований, например для получения хорошо види­мых в толще среды изолированных колоний анаэробных микроорганизмов, применя­ют осветленные среды. Прозрачные среды получают несколькими способами. Наиболее простой способ осветления — фильтрование среды через ватный фильтр. Если этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков куриного яйца. Для осветле­ния 500 мл среды достаточно одного яйца. Белок отделяют от желтка и встряхивают с равным объемом воды до образования сплошной пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплавленную и остуженную до 45 — 50 °С среду. Перед внесением белка проверяют рН и, если необходимо, доводят его до 7,0 — 7,3. Среду с белком тщательно перемешивают и прогревают при 100 °С в автоклаве в течение часа. Белок свертывается и адсорбирует все взвешенные в среде частицы. Когда свернувшийся белок поднимает­ся на поверхность или опускается вниз, среду быстро отфильтровывают в горячем виде через вату. При этом удобно пользоваться специально подогреваемыми подставками для воронок, благодаря которым предотвращается застывание среды во время фильт­рования.

Синтетические агаризованные среды, в которые вносить белок нежелательно, ос­ветляют следующим образом. Среду наливают в химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 10— 12 ч, обычно на ночь. При таком медленном остывании все взвешенные частицы оседают на дно. Застывшую агаризованную среду извлекают из стакана, верхнюю (прозрачную часть) срезают, поме­щают в колбу и вновь стерилизуют.

 

Стерилизация фильтрованием.

Филь­трованием стерилизуют синтетические среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающи­еся или летучие компоненты — вита­мины, аминокислоты (цистеин и цистин), белки, ароматические углеводо­роды, антибиотики и др. Фильтрование жидкостей осуществляют через мелко -пористые материалы, легко адсорбиру­ющие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин и т.д.

Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор ко­торых не превышает 0,7 мкм. В практике же пригодность фильтров для стерили­зации устанавливают путем пробной фильтрации через них суспензии какого-нибудь мелкого микроорганизма, например Serratia marcescens. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высевают на питательную среду. Если в течение 5 сут тест-организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации. Широкое распространение получили мемб­ранные фильтры. Это диски разного размера, диаметра, напоминающие бумаж­ные. Их готовят на основе нитроцеллюлозы. Мембранные фильтры в зависимо­сти от величины пор применяют для фильтрования и стерилизации. Для стери­лизации используют фильтры с номера 1 до номера 4 фирмы «Владипор» (Рос­сия), фильтры с номера 5 до номера 10 фирмы «СИНПОР» (Чехия) и марок VF, VM, VC, SLGS, SLHA, DA фирмы «МИЛЛИПОР» (США).

Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называют­ся фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор они обозначаются разны­ми индексами: ЕК — поры диаметром 1,5 — 1,8 мкм; ЕКS — 1,2—1,5; ЕКS-1 — 1,0— 1,2; ЕКР — 0,8— 1,0 мкм. В России выпускают асбестовые фильтры марок Ф₂ и СФ. Стерилизующими являются СФ-3 и СФ-4.

Асбестовую пластинку помещают в специальный держатель, который обычно изготавливают из нержавеющей стали, и крепко зажимают винтами между верхней (цилиндрической) и нижней (воронкообразной) частями держателя. Трубка нижней части держателя через резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде называют фильтром Зейтца.

Для стерилизации используют стеклянные пористые фильтры, а также изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка — «свечи» Шамберлана и из инфузорной зем­ли — «свечи» Беркефельда. Пористость пер­вых обозначается буквой L с цифрами от 1 до 13 соответственно уменьшению диаметра пор фильтра от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые «све­чи» обозначаются маркой В, крупнопористые - F. Фильтры Беркефельда обозначают буквами V, N, W, что соответствует следую­щим размерам пор (мкм): 8—12, 5 — 7, 3 — 4.

«Свечи» и специальные держатели с зак­репленными в них асбестовыми фильтрами герметически соединяют с колбой Бунзена для фильтрации в вакууме (рис. 4.3). Перед употреблением фильтры, их держатели и при­емник фильтрата должны быть простерилизованы.

Мембранные фильтры стерилизуют автоклавированием при 1 ати 15 мин или длительным кипячением. Держатель вместе с резиновой пробкой завора­чивают в бумагу и автоклавируют при 1 ати 20 — 30 мин. Фильтры Зейтца автоклавируют в собранном виде.

«Свечи» стерилизуют вместе с резиновыми пробками в автоклаве. Колбу Бунзена закрывают ватной пробкой, в отводную трубку вставляют тампон и стерилизуют горячим воздухом — сухим жаром.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ИНСТРУМЕНТОВ И ПРИБОРОВ

Мелкие металлические инструменты: петли, иглы, пинцеты, ножницы, шпатели — стерилизуют прокаливанием в пламени (т.е. нагреванием докрас­на) непосредственно перед использованием. На пламени кратковременно об­жигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при пересевах культур и разливах сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов.

Наряду со стерильными одноразовыми шприцами в лабораторной практике широко распространены традиционные шприцы многократного использования. Их лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160 °С в собранном либо в разоб­ранном виде. В первом случае длительность стерилизации 75 мин, во втором —60 мин. Собранные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой ватной пробкой, разобранные заворачивают в бумагу или ткань. Можно стери­лизовать шприцы и в автоклаве при 1 ати в течение 15 — 20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются. Прокаливать шпри­цы нельзя, так как от этого они портятся.

Термостойкие приборы для культивирования микроорганизмов, а также детали к этим приборам, резиновые пробки и шланги стерилизуют в автоклаве. При этом емкости завертывают в бумагу. Режим автоклавирования выбирают в соответствии с термостойкостью материала, из которого сделан прибор.

Некоторые предметы (металлические инструменты, мелкие стеклянные де­тали, мембранные фильтры) иногда стерилизуют длительным (в течение 20 — 30 мин) кипячением в дистиллированной воде. Металлические и стеклянные предметы лучше всего кипятить в специальных закрытых сосудах — стерилиза­торах. Можно использовать для этой цели и металлическую посуду. Мембран­ные фильтры обычно кипятят в колбе или химическом стакане, закрытых ват­ными пробками. Однако этим способом стерилизации в микробиологической практике пользуются редко в связи с тем, что длительное кипячение может повредить обрабатываемый материал, а сокращение времени кипячения мо­жет не обеспечить стерильность, так как споры некоторых микроорганизмов способны сохранять жизнеспособность даже после длительного кипячения. Надежность стерилизации при кипячении может быть увеличена внесением в воду какого-либо бактерицидного средства: 2%-го формальдегида, 1%-й брил­лиантовой зелени или 0,1%-й сулемы. Но в этом случае возможно загрязнение биоцидами стерилизуемых предметов.