Радиоиммунологические методы

Радиоиммунологические методы в настоящее время, вероятно, наи­более широко применяются для количественного определения гормонов и многих других соединений в биологических жидкостях. Как показывает само название, радиоиммунологический метод представляет собой иммунологическое исследование, в котором ис­пользуют меченые гормоны или связывающие их антитела. Более 20 лет назад Berson и Yalow [26] предложили радиоиммунологиче­ский метод определения инсулина. Этот метод основывался на их наблюдении, согласно которому в периферической крови больных диабетом, получавших инсулин, присутствует белок (который, как было показано позднее, является глобулином), связывающий инсулин, меченный ¹³¹I Значение этих данных и последующей раз­работки радиоиммунологического метода определения инсулина подчеркивается присуждением Yalow и Berson нобелевской пре­мии. Вскоре после первых сообщений этих исследователей други­ми лабораториями были разработаны и описаны соответствующие методы для определения других гормонов. В этих методах приме­няются либо антитела, либо сывороточные белки, связывающие определенный гормон или лиганд и несущий радиоактивную мет­ку-гормон, конкурирующий со стандартным гормоном или гормо­ном, присутствующим в биологической пробе.

Термодинамически взаимодействие антигена и антитела можно рассматривать как реакцию псевдопервого порядка, которая схе­матически может быть представлена следующим образом

где Аг — антиген или гормон, at — антитело к антигену или гормону, Аг — радиоактивно меченный антиген или гормон. Kd — константа скорости диссоциации. Ка — константа скорости ассоциации.

 

 

Рис. 5—1. Кривые доза—реакция, полученные с помощью трех разных методов определения гормонов. а—преобразования данных в системе logit-координат, где N—импульсы, обуслов­ленные неспецифическим связыванием, В_о — максимальное число импульсов свя­занного гормона, когда в инкубационной среде присутствуют только антитела и меченый гормон; б — данные представлены как отношение импульсов связанного гормона (В) к импульсам (F) против логарифма концентрации гормона; в — кривая доза — реакция для определения стероидного гормона в координатах В/Т против дозы гормона, где Т — общее число импульсов.

 

Реакция антиген—антитело обратима, но скорость диссоциации комплекса антиген—антитело значительно меньше, чем скорость его ассоциации. Количество гормона, связанное с антителом, явля­ется результирующей скоростей ассоциации и диссоциации.

Поскольку в каждую пробирку вносят постоянную концентра­цию антител и меченого гормона, количество импульсов, связан­ных с антителами, должно зависеть от концентрации немеченого гормона, добавляемого в виде стандарта или неизвестной пробы. Чем выше концентрация немеченого гормона, тем меньшим ока­зывается количество импульсов, связанных с антителами, присут­ствующими в системе в фиксированной концентрации. На рис.5—1 приведены различные часто применяющиеся способы графическо­го изображения результатов радиоиммунологических исследований. Верхний график представляет собой кривую доза—реакция в логарифмических координатах, где по оси ординат отложено чис­ло импульсов гормона, связанного с антителами, приведенное к максимальному числу связанных импульсов (Во), когда инкубиру­ются только антитела и меченый гормон (без немеченого). Это по­строение в системе logit-log координат обычно представляет собой прямую линию, что облегчает визуальную интерполяцию количе­ства гормона в неизвестной пробе. С целью получения прямой линии, облегчающей визуальную интерполяцию количества гор­мона в неизвестных пробах, применяют различные способы транс­формации данных. Большинство результатов радиоиммунологиче­ских определений подвергается машинной обработке, позволяю­щей избежать утомительных и длительных расчетов.

Получение высокоочищенных гормонов дало возможность раз­работать чувствительные радиоиммунологические методы для точ­ного измерения низких физиологических уровней циркулирующих гормонов, требующие относительно малых объемов биологических жидкостей. Для чувствительных радиоиммунологических опреде­лений необходимо следующее 1 — высокоочищенный гормон, несущий радиоактивную метку с достаточно высокой удельной активностью, чтобы в каждую про­бирку можно было вносить только «следовые» его количества; 2 — реактивы, используемые в реакции присоединения метки, не должны изменять иммунореактивности гормона в существен­ной степени; 3 — антитела с достаточно высокой чувствительностью (сродст­вом) и специфичностью, чтобы определить низкие физиологиче­ские уровни нужного гормона; 4 — соответствующий препарат сравнения, по отношению к ко­торому можно было бы интерполировать неизвестные концентра­ции гормона в неизвестной пробе. Препарат сравнения и исследуе­мый гормон должны одинаково взаимодействовать с антителами и давать параллельные кривые доза—реакция.

В надежных системах для радиоиммунологического определе­ния концентрация меченого гормона и антител фиксирована. В связи с этим по мере увеличения концентрации немеченого гор­мон уменьшается вероятность связывания меченого гормона с антителами, что обусловливает обратное соотношение между чис­лом молекул меченого гормона, связанных с антителами, и концен­трацией немеченого гормона в реакционной смеси.

В отношении взаимодействия антигена с антителами прини­маются некоторые допущения 1 — присутствующий гормон гомогенен и взаимодействует с антителами с равным сродством независимо от того, содержит он радиоактивную метку или нет; 2 — присутствующие антитела гомогенны и одна молекула ан­титела взаимодействует с одной молекулой гормона; 3 — два разных вида молекул — гормон и антитела — реагиру­ют до тех пор, пока между ними не установится равновесие; 4 — применяется эффективное средство разделения связанного с антителами и свободного гормона, причем методика разделения не нарушает исходного равновесия, достигнутого между гормоном и антителами.

Хотя перечисленные допущения идеализируют ситуацию, но они приблизительно очерчивают условия радиоиммунологических исследований. С помощью соответствующих методов удается опре­делить такие концентрации гормонов, которые обычно не подда­ются определению большинством биологических методов in vivo. Под чувствительностью или наименьшей определимой дозой пони­мают ту концентрацию гормона, которая вызывает значимое изме­нение процента связывания меченого гормона с антителами при сравнении с «пустой» пробой. Чувствительность определения за­висит от сродства гормона к специфическим антителам.

 

ЙОДИРОВАНИЕ

Наиболее широко применяемым методом йодирования белков яв­ляется, вероятно, модифицированный метод, предложенный Green­wood, Hunter и Glover [27]. В нем используется окисляющий агент хлорамин Т, превращающий Na¹²⁵I в свободный йод, который затем включается главным образом в остатки тирозина. При использова­нии этого метода могут йодироваться и остатки гистидина. Для сохранения максимальной иммунореактивности необходимо, чтобы на молекулу гормона приходился только один атом ¹³¹I или ¹²⁵I, поскольку большая степень йодирования обычно снижает иммуно­логическую и биологическую активность гормона, изменяя его химические свойства [27].

В настоящее время применяют и другие способы йодирования. Второе по популярности место занимает, по-видимому, фермента­тивный метод с использованием лактопероксидазы [28, 29]. В при­сутствии перекиси водорода, добавляемой непосредственно в реак­ционную смесь, лактопероксидаза превращает Na¹²⁵I в свободный йод, который избирательно включается в остатки тирозина. По­скольку перекись водорода является сильным окислителем, дейст­вие ее высоких концентраций на гормон может изменять его химические свойства; поэтому перекись водорода обычно добавля­ют двумя или тремя небольшими порциями, которые быстро ис­пользуются в реакции. Другим, более новым, но менее распростра­ненным методом йодирования, является метод, разработанный Bolton и Hunter [30]. В нем возможность вредных эффектов хлора­мина Т, бисульфита натрия и перекиси водорода, применяемых в двух других методах йодирования, на гормон сводится к минимуму. С помощью хлорамина Т йодируют промежуточное соединение-­сложный эфир, образованный N-оксисукцинимидом и 3-(р -оксифенил)-пропионовой кислотой, которое затем конденсируется с аминогруппами полипептидного гормона. Такой подход позволяет избежать воздействия на гормон сильных окислителей или восста­новителей. Эта методика несколько громоздка и пока не получила широкого распространения.

 

 

Рис. 5—2. Схематическое изо­бражение молекулы g-глобулина или антитела. Участки, «узнающие» гормон, могут содержать разные аминокис­лотные области легких и тя­желых цепей иммуноглобули­на. Легкие цепи ковалентно связаны с тяжелыми дисуль­фидными мостиками, обозна­ченными знаком S. Одна дисульфидная связь имеется и между двумя тя­желыми цепями. Недавно полученные данные указывают на Y-образную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, в которой участки коплексирования с антигеном расположены в верхней части этой фигуры.

 

В настоящее время используют не Na¹³¹I, a Na¹²⁵I, поскольку он обладает значительно большим периодом полураспада: 59 дней вместо 6. Однако при работе с ¹²⁵I необходима особая тщатель­ность, так как его удельная g-активность значительно ниже, чем у ¹³¹I. Стероидные гормоны и витамин D метят тритием, что позволя­ет получить более высокую удельную активность, чем с помощью метки ¹⁴C. Полипептиды, не имеющие в своем составе остатков ти­розина или гистидина, можно модифицировать, вводя или присо­единяя тирозин к их структуре без видимого изменения конформа­ции нативного соединения. Выбирают такие замещения, которые с наименьшей вероятностью изменят конформацию молекулы.

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ

Антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов и являются преимущественно g-глобулинами (IgG). Молекула IgG состоит из 4 полипептидных цепей: двух тяжелых и двух легких, располо­женных симметрично и ковалентно связанных друг с другом дисульфидными мостиками. Схематическое изображение этой моле­кулы приведено на рис. 5—2. Взаимодействие антигена, или лиган­да, с антителом можно уподобить контакту «замка и ключа». Форма комплексобразующего участка антитела комплементарна тако­вой участка антигена. Связь между антигеном и антителом обу­словлена сочетанием электростатических, водородных и ван-дер-ваальсовых взаимодействий [31, 32]. Форму связывающего участка и тем самым сродство и специфичность связи молекулы IgG с нужным антигеном определяет аминокислотная последователь­ность комплексообразующего участка этой молекулы [33].

Для получения системы определения гормона высокоочищен­ный гормон вводят лабораторным животным, индуцируя у них синтез иммуноглобулинов, обладающих достаточно высокой специ­фичностью и чувствительностью, чтобы их можно было использо­вать для радиоиммунологических определений. Как правило, со­единения с размерами молекул менее 1000 дальтон недостаточно иммуногенны и для придания им свойств активных нммуногенов их нужно соединять с молекулой-носителем. Иммуногеном назы­вается вещество, способное индуцировать образование антител. Для того чтобы обеспечить возможность индукции антителообразо­вания, небольшие молекулы, или гаптены, можно соединять с та­кими веществами, как альбумин, тироглобулин или гемоцианин. Иммуногенная реакция обычно выше в случае введения тех бел­ков-носителей, которые и сами являются высокоиммуногенными. В связи с этим такие вещества, как альбумин, тироглобулин и ге­моцианин являются более подходящими белками-носителями, чем полилизин или другие синтетические полиаминокислоты, при ин­дукции синтеза специфических антител к конъюгированным гаптенам. Стероиды, тиреоидные гормоны (трийодтиронин и тироксин) и различные формы витамина D, как правило, требуют конъюга­ции с белками-носителями. Необходимо тщательно следить за тем, чтобы в процессе конъюгации стероидов и других гаптенов прини­мала участие та часть молекулы, изменение которой в наименьшей мере сказывалось бы на стереоспецифичности этой молекулы. На­пример, антитела к 17 b-эстрадиолу лучше всего образуются при ковалентном присоединении его 6-кетоаналога к альбумину, т. е. при сохранении интактности 3- и 17-гидроксильных групп, равно как и кольца А, стероида. Последнее особенно важно, поскольку именно эти структуры придают данному эстрогену специфичность.

За многие годы разработаны разнообразные методики иммуни­зации, но все они, по существу, являются модификациями ориги­нальной методики Фрейнда [34]. Эмульсия, содержащая гормон, или иммуноген, соответствующее масло и убитые нагреванием ту­беркулезные палочки, вводят внутри- или подкожно. С получе­нием высокоочищенных гормонов и других производных удалось разработать методику иммунизации малыми количествами имму­ногена [35]. Имеются надежные экспериментальные доказательст­ва образования специфических обладающих высоким сродством антител к малым дозам иммуногена [36]. Именно малые дозы иммуногена с наибольшей вероятностью обусловливают продук­цию специфических иммуноглобулинов теми клетками, которые образуют антитела с наиболее высоким сродством к иммуногену. В связи с этим при применении больших доз иммуногена повыша­ется вероятность выработки антител, обладающих низким сродст­вом. При введении очень больших доз иммуногена у иммунизиро­ванных животных может наблюдаться феномен толерантности, когда антитела вообще не образуются или образуются в очень низких титрах [37, 38]. После начальной иммунизации обычно дол­жно пройти минимум 6 нед, чтобы появились значительные титры антител. Сродство антител продолжает увеличиваться и достигает максимума обычно между 8-й и 12-й неделей после начальной иммунизации [35, 39]. Эмпирически установлено, что повторная иммунизация животного обеспечивает лучшую реакцию в том слу­чает, если повторные инъекции производят в период снижения титра циркулирующих антител. При повторном введении 1/2 или 1/4 дозы гормона, использованной при первичной иммунизации, значительное повышение титра циркулирующих антител наблюдается уже через несколько дней. Повторную иммунизацию животного следует производить в ту же анатомическую область, в кото­рую иммуноген вводили первый раз. Больше того, для воспроизве­дения реакции «по памяти» уже не нужно вводить убитые нагре­ванием туберкулезные бациллы, которые могут увеличивать забо­леваемость и смертность животных.

Для получения специфических антител следует выбирать те виды животных, которые легко доступны, не слишком дороги и у которых структура своего собственного эндогенного гормона зна­чительно отличается от применяемого для иммунизации. Напри­мер, хотя СТГ у животных разных видов обладают одинаковой биологической активностью, но они существенно различаются по аминокислотному составу. Эти различия в первичной структуре, как и некоторые другие недостаточно охарактеризованные факто­ры определяют иммуногенность гормона для других видов живот­ных. В некоторых случаях аминокислотные последовательности могут различаться относительно слабо и поэтому нужно с особой тщательностью подбирать вид животного, которому вводят гормон. Например, структура инсулина у человека, кролика и овцы почти одинакова, но инсулины человека и морской свинки различаются сильнее. Для получения специфических антител к инсулину чело­века лучше всего использовать именно морских свинок [40].

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ СИСТЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

После получения антител от иммунизированного животного и опре­деления их концентрации проводят оценку чувствительности и спе­цифичности антисыворотки. Концентрацию антител в сыворотке вначале определяют по связыванию меченого гормона, который применяли для иммунизации, причем используют разные разве­дения антисыворотки. Этот способ называется титрованием и под титром понимают концентрацию молекул антител в сыворотке. После нахождения той концентрации антител, которая в равновес­ных условиях связывает 30—40% меченого гормона, определяют чувствительность и специфичность антител. Получение и харак­теристика специфических систем для определения ХГЧ и инсули­на очень подробно изложена в других публикациях и может слу­жить ориентиром при получении других специфических радиоим­мунологических систем определения гормонов.

В реальных условиях антитела, получаемые для использования в клинических радиоиммунологических исследованиях, содержат популяцию иммуноглобулинов, обладающих различной специфич­ностью и сродством. Следует выбрать антисыворотку, содержащую популяцию антител с достаточно высоким сродством и специфич­ностью к тому гормону, который предстоит определить. На прак­тике выбрать такую популяцию антител с высоким сродством мож­но путем достаточно высокого разведения антисыворотки, чтобы роль других популяций антител, обладающих низшим сродством и, возможно, неспецифических, стала относительно несущественной.

 

 

Рис. 5 — 3. Кривая доза — реакция для ХГЧ-a, определяемого в гомологич­ной для него радиоиммунологической системе. Три кривые доза — реакция для ХГЧ-а получены в условиях, отличающихся только концентрацией антител к ХГЧ-a. При увеличении начального отношения В/Т с 25 до 60% вследствие увеличения концентрации антител точка на оси абсцисс, соот­ветствующая 50% снижению исходного связывания, сдвигается с 0,12 до 0,24 нг в пробе. 1 — В/Т=25%: 2 — В/Т=32%: 3 — В/Т =60%. Обозначения см. на рис. 5-1;

 

При выборе такого разведения антисыворотки, которое отлича­ется от использованного вначале для характеристики системы, необходимо заново определить ее чувствительность и специфич­ность, поскольку в ином разведении концентрация других по­пуляций антител может оказаться относительно высокой, и разве­денная антисыворотка будет обладать меньшей чувствительностью и специфичностью. Такая ситуация графически представлена на рис. 5—-3, на котором кривая доза—реакция для высокоочищенного лиганда смещена вправо, что отражает снижение чувствитель­ности системы по мере увеличения концентрации антител. Поскольку гормоны содержатся в крови в относительно низких концентрациях (10^–12—10^–9 М), необходимо отбирать антитела с высоким сродством и специфичностью. Сродство и специфичность каждого разведения антител нужно определять эмпирически. Боль­ше того, антисыворотка, получаемая от одного и того же животно­го в разное время после иммунизации, может обладать сущест­венно различающимися сродством и специфичностью по отноше­нию к гормону, которым иммунизировали животное.

 

СПЕЦИФИЧНОСТЬ СИСТЕМЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Следует учитывать как структуру, так и степень очистки гормо­на, используемого для иммунизации. Гликопротеиновые гормоны человека (ЛГ, ФСГ и ТТГ), а также хорионический гонадотропин, имеют общую четвертичную структуру и состоят из двух различ­ных субъединиц, обозначаемых как a и бета [42]; a-субъединица, по существу, совершенно одинакова во всех этих гормонах с точки зрения ее аминокислотной последовательности. Иммунологическую и биологическую специфичность этим гормонам придает b-субъ­единица. В связи с этим необходимо тщательно выбирать антисы­воротку, полученную к любому из гликопротеиновых гормонов, и тщательно проверять, достаточно ли она специфична, чтобы мож­но было определить концентрацию данного гормона в присутствии в той же пробе высокого уровня других гликопротеиновых гормо­нов. В некоторых случаях перекрестной реакции, обусловленной общностью антигенных детерминант, можно избежать, адсорбируя антитела на общем антигене. Например, если антисыворотка к ТТГ обнаруживает перекрестную реакцию с ФСГ и ЛГ и эта перекрест­ная реакция обусловлена общими детерминантами a-субъединицы, то данную антисыворотку можно очистить с помощью свободной a-субъединицы или ХГЧ, который содержит a-детерминанты. Такая «очищенная» антисыворотка в идеальном варианте специ­фична по отношению к ТТГ и практически не менее чувствительна к этому гормону.

Проблема еще больше усложняется в связи с тем, что b-субъ­единицы ХГЧ и ЛГ обладают выраженной структурной гомологи­ей, что и делает биологическую активность этих двух молекул неотличимой. В результате антитела, образующиеся к целым моле­кулам ЛГ и ХГЧ, по всей вероятности, будут взаимодействовать с любой из них и обоими вместе. Поскольку некоторые опухоли экто­пически секретируют ХГЧ и поскольку высокие концентрации ХГЧ присутствуют и в нормальных условиях при беременности, при обычном определении ЛГ должны получать завышенные ре­зультаты, трактовать которые нужно с большой осторожностью. Наилучшим клиническим доказательством преимущественного присутствия в периферической крови ХГЧ, а не ЛГ, является рез­кое расхождение концентраций ЛГ и ФСГ в одной и той же пробе; Загрязнение гормонального препарата, используемого для им­мунизации животного, другим гормоном может создавать и другие методические проблемы. Даже в высокоочищенных препаратах гормонов гипофиза человека присутствуют небольшие, но сущест­венные примеси других гипофизарных гормонов. Это справедливо также для гормонов, получаемых в чистом виде из поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта. Очевидно, что у иммуни­зированного этими гормонами животного могут образовываться антитела к любому из попавших в его организм гормонов, в том числе и к тем, которые присутствовали в виде примесей, В связи с этим необходимо знать источник гормона, поскольку в процессе его очистки могут одновременно очищаться и другие гормоны, попадающие в конечный препарат. В идеальном случае следовало бы проверить структурное сходство гормонов, так как именно оно может служить основой перекрестной реактивности некоторых ан­тисывороток по отношению к разным гормонам.

ЭФФЕКТ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Поскольку между различными стероидами, между тироксином и трийодтиронином и некоторыми их метаболитами и между различ­ными формами витамина D отмечается выраженная структурная гомология, не всегда возможно получить антисыворотку, доста­точно специфическую, чтобы без предварительного применения методов экстракции и разделения избирательно определять эти гормоны и их метаболиты. Некоторые гормоны циркулируют в кро­ви, будучи связанными со специфическими белками-переносчика­ми или более рыхлой связью с альбумином. Для того чтобы избе­жать загрязнения радиоиммунологической системы связывающими белками сыворотки, необходимо вначале экстрагировать гормон соответствующим растворителем. Начальную экстракцию следует проводить и при малой специфичности антител к гормону. В неко­торых случаях может оказаться достаточной дифференциальная экстракция, но в других необходимо произвести хроматографическое разделение гормонов. К наиболее распространенным средст­вам разделения структурно близких стероидов относятся тонко­слойная хроматография и хроматография на колонках сефадекса LH-20. Поскольку крупные полипептидные гормоны циркулируют в крови, не будучи связанными с белками-переносчиками, началь­ный этап экстракции в этом случае не нужен, и аликвоту сыворот­ки можно прямо помещать в пробирку для анализа. Однако содер­жащиеся в сыворотке протеазы могут обусловить занижение кон­центрации некоторых полипептидных гормонов. Если разрушение гормона существенно изменяет его структуру, он может и не реа­гировать с антителами. В результате появляется необходимость добавления в пробу ингибиторов ферментов, чтобы противодейст­вовать эффекту протеаз. К ингибиторам протеаз, добавляемых в сосуды с пробами на АКТГ, глюкагон и другие гормоны, которые могут подвергаться быстрой протеолитической деградации, отно­сятся трасилол и бензамидин.

В отношении некоторых полипептидных гормонов отмечаются неспецифические эффекты сывороточных белков. Эти неспецифи­ческие белковые эффекты можно нивелировать, добавляя пустую сыворотку в пробирки для исследования, не содержащие сыворот­ки, с тем, чтобы все пробирки содержали сравнимые концентрации мешающих определению сывороточных белков. Каждую антисыворотку можно эмпирически проверять на неспецифический эффект белка в отношении реакции антиген—антитело.