Основные предпосылки возникновения биотехнологии.

Генетического конструирования микроорганизмов: мутагенез и методы выделения мутантов.

В живой клетке одновременно синтезируется множество соединений.Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма.

Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями:

1) путем спонтанного изменения генетической природы организма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы;

2) путем индуцированного мутагенеза. Метод основан на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (таких как, азотистая и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лучей.

Генетическое конструирование in vivo включает получение и выделение мутантов, и использование различных способов обмена наследственной информацией живых микробных клеток. Важнейшим методом селекции м/о является отбор мутантов, т. е. организмов с измененными наследственными признаками, которые появляются в результате мутаций. Различают мутации:

1.Цитоплазматические – затрагивающие внехромосомные генетические детерминанты, с материалом у эукариот – в митохондриях, у прокариот – в плазмидах;

2 Ядерные или хромосомные – затрагивают изменение числа хромосом. Ядерные делятся на 3 типа:

1 – изменение числа хромосом; 2 – изменение числа и порядка расположения генов (структурные мутации); 3 – внутригенные мутации.

В селекции м/о основное значение имеют 2 последних типа. Структурные мутации:

1 делеции – выпадение участков хром;

2 дупликации – удвоение генов;

3 амплификации – умножение числа отдельных генов или групп генов; 4 транслокации – обмен участками между хромосомами;

5 транспозиции – вставка участка хром. в новые места;

6 инверсии – изменение порядка расположения генов на хромосоме. Внутригенные мутации (изменяют последовательность оснований ДНК в пределах одного гена):

1 транзиции – замена 1 основания;

2 трансверсии - замена пуриновых оснований;(в клетках такого типа мутанта синтезируется неактивный белок с измененной последовательностью аминокислот);

3 реверсия – возвращение к дикому типу(в ДНК восстанавливается исходная последовательность оснований).

Реверанты – мутанты, вернувшиеся к дикому типу могут быть спонтанными, индуцированными. Спонтанные, неконтролируемые мутации возникают с низкой частотой Для обнаружения спонтанных мутаций используют селективные среды, индикаторные (когда невозможно провести прямой отбор мутантов) среды. Так изучают морфологию клеток, сдвиг рамки считывания. В качестве тест – культур используют ауксотрофы, дающие рост в том случае, если мутанты выделяют в среду искомый метаболит, а так же чувствительные культуры, рост которых подавляется, если мутант продуцирует антибиотик. В этом случае по зоне роста или зоне ингибирования роста тест – культуры можно говорить о продуктивности мутанта.

Получение ауксотрофных мутантов с помощью метода отпечатков может быть облегчено, если обогащать ими популяцию клеток, используя пенициллин или его аналоги. Эти антибиотики убивают только растущие клетки. Ауксотрофы дают высокий выход продукта. Для повышения частоты мутаций м/о подвергаются физиологическому воздействию ультрафиолетовые волн (индуцированный мутагенез). Применение мутагенов (УФ) повышает частоту мутаций в 100- 1000 раз. Для E. Coli выделение пролина в среду в том

Каллусные и суспензионные культуры растительных клеток in vitro.

Культура одиночных клеток

Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.

Общие требования к выращиванию:

Асептика. Фрагменты ткани или органы растения – экспланты – могут быть ингибированы токсинами микроорганизмов, поэтому все операции должны проводиться в асептических условиях. Для этого чистую посуду и питательную среду стерилизуют в автоклавах. Комнаты обрабатывают хлорамином, а затем ультрафиолетовыми лампами. Растение промывают водой с мылом, споласкивают чистой водой, затем промывают в растворах дезинфицирующих веществ.

Питательные среды. В состав сред входят макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. В среды обязательно вводят ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. При приготовлении твердых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей. Универсальной является среда Мурасиге и Скуга.

Типы культур клеток и тканей:

1. каллусная(поверхностное культивирование)а)плотные ткани,б)средней плотности,рыхлые,2суспензионная

Культура изолированных тканей обычно представлена каллусными и гораздо реже опухолевыми тканями. Возникновение каллуса связано с неорганизованным делением дедифференцированных клеток. Дедифференцировка – основа для создания каллусной ткани. В процессе дифференцировки клетки теряют способность делиться.

Общая характеристика каллусных клеток. Каллусная клетка имеет свой цикл развития, аналогичный циклу всех других клеток: деление, растяжение, дифференцировку, старение и отмирание. Культивируемые каллусные клетки и ткани сохраняют многие физиологические особенности, свойственные клеткам растения,у каллусных клеток появляются свои, характерные для них, особенности.

Физиологическая асинхронность заключается в том, что в каждый данный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют.

Генетическая гетерогенность – нестабильность генома. Генетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при культивировании могут возникать полиплодия, анеуплодия, хромосомные изменения, генные мутации.

Полиплодия– наследственное изменение, заключается в кратном увеличении числа наборов хромосом в клетках организма Анеуплодия– различные формы аномалий в числе хромосом.

Гормоннезависимость. при длительном культивировании практически у всех тканей может возникнуть специфическое свойство гормоннезависимости, то есть автономности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов,Такие Клетки называют «привыкшими». Ткани, образованные такими клетками, называют «химическими» опухолями.

Методы сохранения генофонда

При получении клеточных линий с полезными признаками встает проблема сохранения этих признаков. Растения могут хранить генетическую информацию в семенах, однако этот источник не вполне надежен, так как со временем из-за мутаций всхожесть семян падает. Кроме того, некоторые растения размножаются только вегетативно. Этим обусловлена необходимость сохранения части материала in vitro.

Существует разные подходы к сохранению культур:

- криосохранение, замедление роста, сушка – для клеток микроорганизмов.

Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте.

Успех низкотемпературной консервации зависит от ряда факторов:

- вид и тип клеток, их концентрация в суспензии, состав среды для консервирования, вид и концентрация криопротектора, режим охлаждения и отогрева, способ реабилитации клеток после отогрева.

Клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему действию низкотемпературной консервации, чем клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста Значение имеет и плотность замораживаемой суспензии.

Замораживание производят в специальных аппаратах.

Замедление роста:

1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).

2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда

3. Изменение светового режима.

4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.

5.Применение гормональных и осмотических ингибиторов

Плазмиды агробактерий

В качестве векторов могут использоваться опухолеобразующие плазмиды бактерий. Виды Agrobacterium относящимся к роду Rhizobium. Особенность -один из партнеров специфически видоизменяет свойства хозяина, встраивая свои гены в его геном.

Хлоропластная и митохондриальная ДНК Хлоропласты и другие пластиды обладают одинаковой генетической информацией, так называемым пластомом. У высших растений он представляет собой замкнутую молекулу ДНК длиной 150 т. н. п., достаточную для кодирования примерно 100 белков. Для синтеза пластид необходимо значительно больше белков. Остальные белки кодируются ядром, синтезируются в цитоплазме и поступают в хлоропласты. Некоторые важнейшие белки хлоропластов состоят из нескольких субъединиц, часть из них синтезируется на рибосомах цитоплазмы и транспортируется в хлоропласт, где они объединяются с другими полипептидами, закодированными в самом хлоропласте и там же синтезируемыми. В отличие от хлоропластной, ДНК митохондрий характеризуются исключительным разнообразием и их величина колеблется от 200 до 2400 т. н. п.. В составе митохондриальной ДНК имеются структурные гены, кодирующие полипептиды, гены рибосомных и транспортных РНК. Однако большая часть белков митохондрий, как и хлоропластов, кодируется ядерными генами.

Транспозо́н — последовательность ДНК, способная перемещаться внутри генома в результате процесса, называемого транспозицией. Транспозоны — один из классов мобильных элементов генома, которые, встраиваясь в геном, могут вызывать мутации, в том числе и такие значительные как хромосомные перестройки. Они играют важную роль в процессах переноса лекарственной устойчивости средимикроорганизмов, рекомбинации, и обмена генетическим материалом между различными видами как в природе (горизонтальный перенос генов), так и в ходе генно-инженерных исследований..

Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень.Необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. После трансплантации генов лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.
Первая стадия – поиск клеток, несущих вектор, например, по приобретенной способности быть устойчивыми к антибиотикам.
Вторая стадия – поиск клеток, несущих и вектор, и ген-мишень. Для этого используют две группы методов:
а) методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:
– определение нуклеотидной последовательности ДНК, когда из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, затем проводят секвенирование;
– гибридизация выделенной ДНК с зондом, который может быть интересующим геном или соответствующей ему м-РНК;
б) методы, основанные на определении признака, кодируемого геном:

– непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени;
– использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень, например, клетки, несущие ген β-галактозидазы культивируют на среде с лактозой;
– иммунологическая детекция, например, при поиске в бактериях α-интерферона человека его связывают с антителами, то есть ген идентифицируют с помощью специфических антител к его белковому продукту.

 

 

Основные предпосылки возникновения биотехнологии.

1)проблема антропогенного загрязнения окр среды. Согласно существующим расчетам предельная величина антропогенного воздействия на биосферу связанная с техич.деятельностью ч-ка не должна превышать 1% от ее полной производительности. В 70гг 20в эта велич составляла 10%. Биосфера саморегулируемая система, поэтому если превысить предельные возможности саморегуляции, то в биосфере начнуться необратимые процессы. В чем выражается воздействие на биосферу: -выделение большого количества СО2, в результате работы энергетич установок и произв.предпр. –возрастает колич-во отходов выбрасываемых в биосферу.

2)недостаток пищевых вещ-в (Белка), вызванный ростом народонаселения, дефицит чистой воды. Пища насел. Промышлен развитых стран общая масса белка 90г, в том числе животного 44г в сутки на чел-ка. В развиввающ странах населен получ 58г белка в т.ч 9г животного. 3)нарастает дефицит как энергет так сырьевых ресурсов. 4) проблема ухудшения состояния здоровья населения и необходимость развития новых средств диагностики и лечения. 5) развитие отдельных направлений в биологии, в частности биохимии, молек биологии, биофизики, генетики, что позволяет на их основе создавать биотехнологии способные решать вышеназваные проблемы.

 

2.Понятие биотехнология. Термин биотехнология был введен в 1917г венгерским инженером Карлом Иреки. При описании процесса выращивания свиней с использованием корма- сах свеклы. Согласно нему Биотехнология – все виды работ, при котороых из сырьевых материалов с помощью энерг организмов производится те или иные продукты. Этот термин в те годы не получил широк распространения. В 1961 к нему вернулись после того как шведский биолог Карл Герн-Хеден порекомендовал изменить название научного журнала по биохимии и биол. инженерии и технологии на название биотехнология и биоинженерия. В настоящее время БТ понимается не однозначно, существует широкое узкое и среднее его толкование. Узкое: Биотехнология- ограничена генно-инженерн. манипуляциями. за предел БТ остается промышленные микробиологические производства.

Широкое: БТ-все технологические процессы, в которых используются все живые организмы. При таком понятии вся с/х –биотехнология.

Если отказаться от обеих позиций, то БТ можно определить по ее основному признаку – возможностью управления биотехнологическими объектами. Биотехнология- направление научно-технического прогресса, использующая биотехнологические процессы и агенты для целенаправленного воздействия на природу и промышленное получение продуктов в конкретных условиях.

 

3.История возникновения и развития биотехнологии. Классификация Еринова: 1й- имперический с 6века до н.э до половины 19 века. С древнего времени человек использовал живые организмы (микроорганизмы) не зная о их существован. 1-м микробиологическим процессом было брожение – процесс обмена веществ, при котором в биологическом субстрате происходит изменение под воздействием микробных ферментов. Применяют при хлебопечении, пивоварении, виноделии. С 3-4 тыс до н.э известны процессы брожения лежащие в основе мочки прядильных растений (волока конопли).

Во второй половине 15в начинается развитие естествознания. Произошел сдвиг в понимани брожения, появилась ферментация, процессы брожения связывали с наличием дрожжей или их ферментов. С 16-17 веков стали использовать пивные дрожжи для разрыхления теста. В 18 веке изучалось способность ферментов к катализу хим.рекции. в рез-те развития описательной микробиологии и изучения хим.превращений стали предпосылкой для становления биохимии. В 19в в химии заложени основы органич.химии, открыты органические кислоты.

2-й- Этиологический(научный) со второй полов19вдо 1/3 20в. Луи Пастер: доказал, что заболевание порча продуктов, гниение, брожение вызываются МО. Создал теорию об экзогенности. Научные теории пивоварения, виноделия, борьба с болезнями. Усовершенствовали среду для выращивания МО. В результате стали применять чистые культуры. Микробиологический антогонизм применяют в медицине.(Мечников). 70-80 гг 19в заложены основы культивирования растит клеток и жив-х. в основу положенны работы: клеточная теория Шванна и Виркова. Открытия законов менделя, которые легли в основу генетики. Т.обр внедрение научных знаний дало возможность приступить к разработке биотехнологий.

3-й-биотехнологический (с 1933-1972) внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметического оборудования, обеспечивающего протекание многих процессов в стерильных условиях. В 1933г Клюйвер и Перкин опубликовали работу по изучению обмена у плесневых грибов, в которой изложили технич приемы их глубинного культивирования. В этот период стали выпускать биоудобрения и биолог препаратыдля борьбы с вредителямии болезнями с/х растений. Революционным моментом была промышленная реализация производства антибиотиков. Отправной точкой послужило открытие Флемингом химико-терапевтического действия пеницилина. В СССР Ермолаева показала что лизоцим является фактором естественного иммунитета. Биотехнологич организованы массовое производства аминокислот, белка, превращения стероидов, культуры кл МО-для производства вакцин. В конце 60х гг разработали и стали использовать технологию иммобилизации ферментов.

4-й генно-инженерный период. 1972 в США Бергом была создана 1-я рекомбинантная молекула ДНК. Возникла генная инженерия. В 1973 г Коэн и Бойр получили рекомбинантные плазмиды и провели им трансформацию кл кишечной палочки. В течении 4х лет после открытия рекомбинантной ДНК появились штаммы бактерий продуцирующих инсулин и человеческий гормон роста.