Механізм дії ферментів : молекулярні механізми ферментативного каталізу.

Хімотрипсин належить до серинових протеаз, тобто в активному центрі ферменту амінокислотний залишок серину відіграє важливу роль у каталітичному перетворенні молекули субстрату. Цей фермент каталізує гідролітичне розщеплення пептидних зв’язків, які утворені амінокислотами Тир, Фен, Трп.

Механізм дії хімотрипсину ілюструє поєднання таких молекулярних механізмів дії, як кислотно-лужний та ковалентний каталіз та включає декілька стадій, які описані нижче.

Етапи ферментативного каталізу хімотрипсину:

1) імідозольна група Гіс⁵⁷ відтягує на себе електронну щільність від –ОН групи Сер¹⁹⁵. Це полегшує атаку пептидного зв’язку молекули субстрату -ОН групою серину:

2) розщеплення пептидного зв’язку, вивільнення 1 продукту реакції та утворення проміжного нестабільного ковалентно зв’язаного комплексу – ацилферменту:

3) атом азоту, що входить до імідозольної групи Гіс⁵⁷, взаємодіє з молекулою Н₂О, яка депротонується і утворює нуклеофільний гідроксид-іон. Саме цей іон атакує ефірний зв'язок в ацилферменті:

4) ефірний зв'язок в ацилферменті розщеплюється, тобто відбувається деацилювання, після чого вивільняється другий продукт реакції:

Після того як другий продукт реакції виходить з активного центру відбувається, регенерація ферменту, і він знову може каталізувати гідроліз наступного субстрату.

Аналогічний механізм дії характерний для ацетилхолін-естерази – ферменту, який гідролітично розщеплює ацетилхо-лін. Цей фермент в активному центрі містить Гіс, Сер, Тир, які беруть участь у формуванні ацилферменту, його розщепленні з утворенням продуктів реакції та регенерації структури активного центру після реакції. Тобто в основі дії ацетилхолінестерази лежать два основних молекулярних механізми – ковалентного та кислотно-лужного каталізу

26.Механізм дії ферментів: стадії ферментативного каталізу,утворення фермент-субстратного комплексу……….

Три стадії ферментативного каталізу:

1. Утворення зворотного фермент-субстратного комплексу (ES). На цьому етапі субстрат певним чином орієнтується в активному центрі ферменту та нековалентно зв’язується з функціональними групами в ньому. Слабкі зв’язки, які утворюються в ході такої взаємодії, можуть руйнуватися, тому субстрат може відділятися від активного центру – стадія зворотна.

2. Утворення однієї або декількох активних форм ES з подальшим утворенням продукту реакції (Р).Відбівається розхитування зв’язків у молекулі субстрату, розрив їх та утворення нових із каталітичним центром ферменту. Ця стадія відбувається найбільш повільно, тому швидкість цієї стадії визначає швидкість усієї ферментативної реакції.

3. Відділення готового продукту реакції від ферменту. Швидкість її перебігу залежить від дифузії продукту в середовище. Ця стадія, як і друга, є незворотною.

В утворенні ферментосубстратних комплексів беруть участь водневі зв’язки, електростатичні та гідрофобні взаємодії.

Термодинамічні закономірності

З термодинамічної точки зору ферменти прискорюють хімічні реакції в організмі завдяки тому, що знижують енергію активації (Ea). Еа введена Сванте Августом Арреніусом для характеристики швидкості реакції. Еа – це мінімальна кількість енергії, яку слід надати молекулам речовини для того, щоб вони подолали енергетичний бар’єр, тобто вступили в реакцію. Тобто за наявності ферменту в реакційному середовищі більша кількість молекул може подо-лати енергетичний бар’єр реакції і перетворитися в продукт.

27.Кінетика ферментативних реакцій:залежність швидкості реакції від концентрації субстрату ……

Кінетика ферментів – це розділ ензимології, який вивчає залежність швидкості ферментативної реакції від хімічної природи та умов взаємодії субстрату з ферментом, а також від факторів навколишнього середовища.

Залежність V ферментативної реакії від рН

Для кожного ферменту існує своє оптимальне значення рН (рН_опт) – це таке рН, при якому швидкість ферментативної реакції оптимальна. При відхиленні від оптимального рН активність ферменту знижується, навіть до мінімуму при значних змінах реакції середовища.

Зміна активності ферменту при різних рН пояснюється:

1) впливом рН на ступінь іонізації функціональних груп в активному центрі ферменту.

2) впливом рН на функціональні групи в молекулі субстрату і, таким чином, на просторову організацію S та спорідненість його до ферменту.

«Дзовоноподібна» залежність активностей ферментів від змін рН визначається їх білковою природою,зсувами в дисоціації змін молекул.Більшість внутрішньоклітинніх та тканих ферментів організму людини найактивніші в нейтральному,слаболужному або слабо кислому середовищі.Ферментами з оптимумами при екстремальниз значеннях рН є пепсин(рНопт=1-2)і аргіназа(рНопт=10-11).

Залежність V ферментативної реакції від t^оС

Дуже важливим є вплив температури на конформаційні зміни в молекулі білка-ферменту і, у свою чергу, на структуру активного центру ферменту.

Кожен фермент має оптимальні значення t^оС, при яких швидкість реакції максимальна, - це температурний оптимум (t^оС_опт). При зростанні температури вище 37-38^оС (температурний оптимум для більшості людей)відбуваються структурні зміни в молекулі ферменту і в його активному центрі, які призводять до зниження активності. Більшість ферментів інактивуються при 40-50^оС. Значне підвищення температури викликає навіть денатурацію молекул білка-ферменту з повною втратою каталітичної активності.

Залежність V ферментативної реакції від концентрації ферменту

В умовах надлишку субстрату в реакційному середовищі залежність швидкості реакції від концентрації ферменту має прямо пропорційний характер (рис.12). Тобто в живих клітинах чим більше молекул ферменту, тим швидше відбувається реакція. Цей принцип закладений в основу одного із шляхів регуляції ферментативних процесів, який має назву «зміна кількості ферментів у клітині». Основними механізмами цього шляху є індукція і репресія синтезу ферментів, які будуть розглянуті нижче у відповідному розділі.

Залежність V реакції від [S].

Ця залежність може бути описана рівнянням Міхаеліса-Ментен,.

Поступово з підвищенням концентрації субстрату відбувається насичення активних центрів ферменту молекулами субстрату. Наближення до максимальної швидкості реакції (Vmax) без подальшої зміни цієї швидкості означає, що усі активні центри молекул ферменту зайняті, і подальше підвищення швидкості неможливе – вона досягла максимально можливого значення (ефект насичення).

28.Рівняння Міхаеліса-Ментен і графічне зображення його компонентів. Використання Кm для хар-ки активності ферментів…..

Рівняння Міхаеліса-Ментена

Km – це така концентрація субстрату ([S]), при якій швидкість реакції дорівнює половині максимальної швидкості (V = 1/2V max) та може служити мірою спорідненості ферменту до субстрату.

Чим менше Km, тим більша спорідненість ферменту до конкретного субстрату. В цьому випадку умови для перебігу реакції є дуже вигідними, тому що рівновага зміщена у бік утворення фермент-субстратного комплексу, і саме тому для перетворення необхідна невелика концентрація субстрату. Крім того, Vmax може бути досягнута саме при незначних концентраціях субстрату.

У разі коли Km має велике значення, спорідненість ферменту до субстрату низька і ферментативну реакцію не можна вважати високоефективною, тому що вона потребує значних концентрацій субстрату.

Vmax та Km – це дві кінетичні константи, за допомогою яких можна характеризувати ефективність будь-якої реакції, у тому числі й in vitro.