Электрофорез, устройство, применение, значение.

Электрофорез основан на том, что при определенной силы pH и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью пропорциональной их суммарному заряду. Белки имеющий отрицательный заряд двигаются к катоду, а положительный- к аноду.

Электрофорез производят на бумаге, крахмальном геле и. др. В полиакриламидном геле лучше проводить электрофорез, т.к в геле движение белков еще зависит от их молекулярной массы, а не только от заряда. На электрофорезе бумажном, различают 5 фракций, (Альбум, а1-глоб, а2-глоб, b-глоб и y-глоб). НО для обнаружения фракция столбики геля или бумагу обрабатывают красителем. Электрофорез на полиакриламидном геле позволяет получить 18-различных фракций.

Виды электрофореза:

1. Свободный (фронтальный) электрофорез. В этом случае электрофорез проводят в приборах, существенной частью которых является U-образная трубка (Рис. 1). Нижнюю часть трубки заполняют испытуемым объектом, например раствором белка, на который наслаивают растворитель. В растворитель погружают электроды, соединенные с источником постоянного тока. При этом электрически заряженные частицы белка перемещаются к одному из электродов, вследствие чего граница раздела между раствором и растворителем в одном колене поднимается (восходящая граница), а в другом опускается (нисходящая граница). Приборы для свободного электрофореза, снабженные устройством автоматической регистрации перемещения каждого компонента в исследуемом объекте, применяют при анализе дисперсных систем, выделении из них отдельных компонентов, а также при клиническом исследованиисыворотки крови.
2. Электрофорез на носителях (зональный электрофорез). В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов и др. В клинических лабораториях особо широкое распространение для исследования сыворотки крови получил электрофорез на бумаге, который проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором (см.), наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускания постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен — о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.
В последнее время широкое применение в исследовательской работе и в клинической диагностике находит электрофорез в тонких слоях гелей, нанесенных на стеклянные пластинки (дисковый электрофорез), а также помещенных в стеклянные трубочки.

Методы разделения и выделения индивидуальных белков из смеси.

Хроматографии, электрофорез, ультрацентрефугирование.

 

Ионнобменная хроматография.

(есть выше)

Аффинная хроматография.

(есть выше)

 

Гельфильтрация.

 

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижно и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества. В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вола и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий модно формировать гранулы с разной величие ой "пор".

Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны пронизать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесенную на хроматографическую колонку, вымывают, отпуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникают внутрь гранул.