Оценка качества спермы (часть III)

Производители	Концентрация млрд/1 мл	Процент живых	Процент патологических
Бык	1-2
Баран	2-4
Хряк	0,1-0,2
Жеребец	0,1-0,2

 

Все исследования спермы проводят при строгом соблюдении действующих стандартов и инструкций по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных.

В результате исследования могут быть установлены следующие недостатки: 1. асперматизм (АЗМ) - отсутствие спермы; 2. олигосперматизм (ОЗМ) - малый объем эякулята; 3. аспермия (А) - отсутствие в сперме спермиев; 4. олигоспермия (О) - малое число спермиев в эякуляте; 5. некроспермия (Н) - мертвые спермии; 6. тератоспермия (Т) – патологические формы.

Производителя можно использовать для естественного или искусственного осеменения, если его сперма соответствует требованиям действующей инструкции по искусственному осеменению животных.

 

 

Лекция № 32

 

«Технология разбавления, хранения и

транспортировки спермы »

 

Вопросы лекции:

 

1. Значение разбавления спермы и классификация разбавителей.

2. Состав сред для разбавления.

3. Методика и степень разбавления.

4. Методы хранения и упаковки спермы производителей.

5. Правила транспортировки спермы.

 

1. Значение разбавления спермы и классификация разбавителей

Важный фактор эффективности искусственного осеменения – максимальное использование выдающихся высокоценных производителей путем осеменения многих самок спермой одного эякулята. Для этого необходимо разбавить сперму, чтобы увеличить ее объем и обеспечить сохранность оплодотворяющей способности на продолжительный срок.

Целью разбавления является создание окружающей среды, способной защитить половые клетки от повреждений в процессе консервирования, увеличения объема полового продукта для разделения его на множество спермодоз. Современный разбавитель должен отвечать следующим требованиям:

– быть изотоничным сперме

– обладать буферной способностью, т.е. противостоять сдвигам рh в кислую или щелочную среду

– защищать спермии от холодового шока при охлаждении до температуры +5⁰С

– покрывать энергетические затраты спермиев на процессы жизнедеятельности

– нейтрализовать продукты метаболизма спермиев

– эффективно подавлять рост микрофлоры

– предохранять половые клетки от повреждения в процессе замораживания и оттаивания

– снижать интенсивность метаболических процессов в спермиях

Впервые предложил разбавлять сперму И.И. Иванов. Затем в науке выделились два направления:

І.– использовать в качестве разбавителей натуральные среды: молоко, кровь, сыворотку крови и др.

ІІ. – стремились заменить секрет придаточных половых желез различными синтетическими средами.

Классификация и состав разбавителей (по Милованову) – 1962 год.

класс А – экстендоры (в переводе увеличители) состоят из 1 или 2-х компонентов, которые служат для увеличения объема спермы (эякулята).

класс Б – протекторы (защищают) это вещества которые защищают сперматозоиды (глицерин, антибиотики).

класс В – имплементоры – среды, оснащенные физически активными веществами, которые оказывают действие на половой аппарат самки.

 

2. Состав сред для разбавления

По химическому составу разбавители делятся:

1 группа – неэлектролитические вещества (энергетические в-ва)

2 группа – солевая

3 группа – фосфолипидная (антишоковая)

4 группа – дополнительные

1 – в качестве экзогенного источника энергии в состав разбавителей вводят сахара (глюкоза, раффиноза, лактоза, гликокол и др. моносахара). Помимо основной роли, они понижают электропроводность среды, тем самым предупреждают потерю отрицательного электрического заряда и агглютинацию спермиев. Сахара выполняют и антитоксическую функцию.

2 – солевая группа – входят соли слабых кислот (лимоннокислый натрий, 3-х замещенный 5-ти водный, хелатон (трилон Б) хлористый К) – создают нужный буфер разбавителя, т.е. защищают сперматозоидов от самоотравления (молочной кислотой).

3 – антишоковая – входит желток свежего куриного яйца, глицерин. В желтке находится лецитин (до 7 %) который обволакивает сперматозоиды оболочкой и предохраняет их от температурного шока, может служить источником энергии. Глицерин – действует по принципу антифриза: легко проникая в клетку (это трехатомный спирт) он понижает температуру замерзания и препятствует образованию кристаллов связанной воды, что позволяет избежать повреждения клеточных структур.

4 – дополнительные вещества: антибиотики, ферменты, гормоны и др.

Антибиотики – пенициллин, стрептомицин, стрептоцид белый водорастворимый – этот комплекс называется спермосан. Бывает спермосан – 3, 4, и др. Действие направлено на подавление развития большой группы микроорганизмов.

Дозы – бактериостатические, но не бактерицидные.

Ферменты – муциназа, каталаза – разжижает секрет слизи истекающей из шейки матки.

Гормональные препараты – усиливают моторику половой системы (окситоцин), нейротропные (прозерин, карбахолин).

Витамины В₃, В₁₂ – способствует лучшей переживаемости сперматозоидов вне организма.

Загустители – чтобы придать разбавленной сперме такую консистенцию, которая соответствует цельной сперме (хлорвиниловый спирт).

Красители – чтобы знать принадлежность спермы к тому или иному виду животных (используется пищевые красители, которые не токсичны).

3. Методика приготовления разбавителя

Вся посуда должна быть чистой и простерилизованной. Все химические реактивы (компоненты) должны быть ХЧ или ХЧДА. Куриные яйца используют только доброкачественные и из хозяйств благополучных по инфекционным заболеваниям.

Разбавитель готовят непосредственно перед получением спермы и хранят не более 3-4 часов.

– в стерильный сосуд высыпают отвешенные в соответствии с рецептом глюкозу и др. вещества (кроме желтка, глицерина и АБ), вливают дистиллированную воду и размешивают.

Затем среду стерилизуют в течение 5-10 минут в водяной бане и охлаждают до 35-40⁰С.

– куриное яйцо моют щеткой, протирают спиртовым тампоном, раскалывают пополам, сливают белок в банку, а желток осторожно перекладывают на стерильный листок фильтровальной бумаги, покатывают его, чтобы снять остатки белка, прокалывают и сливают в колбу.

– желток,АБ,глицерин добавляют в среду, когда температура её не выше 40⁰С.

Техника разбавления

– сперму разбавляют не позже 5-10 мин. после получения на искусственную вагину.

– разбавитель должен быть t-25-30⁰С.

– в измеренное количество спермы медленно, тонкой струей по стенкам вливают порциями отмеренный объем разбавителя, слегка перемешивая покачиванием.

– Следует иметь в виду, что иногда после разбавления подвижность спермиев несколько снижается, но спустя 10-15 мин восстанавливается.

– расфасовку, разбавление спермы проводят в стерильной помещении или настольном боксе.

– биологический контроль среды определяют по выживаемости спермиев при температуре 2-4⁰ при различных степенях разбавления спермы.

Каждая поступающая серия компонентов должна быть проверена на безвредность.

Степень разбавления:

В зависимости от концентрации и активности спермиев сперму производителей сельскохозяйственных животных разбавляют:

– быка в 5-50 раз, т.е. к одному объему спермы приливают 4-49 объемов разбавителя. В одной дозе должно быть не менее 10 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением.

– барана – в 2-4 раза (1:1–1:3)- 80 млн. спермиев.

– жеребца – 2-4 раза (3 млрд. спермиев).

– хряка – 2-9 (1:1-1:9) (3 млрд. спермиев).

Для хранения спермы при 0-5⁰С. её разбавляемой средой, приготовленной по рецепту:

 

 

Среды для разбавления спермы (Г-Ц-Ж)

Вещества	Для спермы
быка	барана	Жеребца
Вода дистиллированная, мл
Глюкоза мед. безводная, г	3,0	0,8	7,0
Натрий лимоннокислый, г	1,4	2,8	-
Желток куриного яйца, мл			0,8
Спермосан, тыс. ЕД.

4. Методы хранения и упаковки спермы производителей

Длительное хранение спермы

Различают два вида анабиоза – естественный – путем создания повышенного осмотического давления, кислой реакции (рН –6,7-6,8) понижении температуры.

– искусственный – за счет резкого охлаждения.

– В 1902 г. Бахметьев – впервые научно обосновал теорию анабиоза.

– В 1907 г. Иванов применил низкие температуры близкие к 0⁰

Существует два способа хранения спермы:

– при 0 – объем снижается в 10 раз но оплодотворяемость сохраняется не боле 3-4 дня.

– глубокое замораживание спермы (наиболее усовершенствованный метод)

Преимущества:

а) – долго храня сперму, можно в течение года равномерно использовать быков-производителей, не допускать их перегрузки.

б) – используется индивидуальный подбор пар.

в) – сперма используется на 100 %, а в предыдущем только 50 %.

г) – проверка производителя по качеству потомства.

д) – создает возможность для крупномасштабной селекции.

е) – позволяет создать заносы спермы.

ё) – позволяет создавать новые породы, линии.

Ив. Васильевич Смирнов под руководством Милованова В.К. впервые заморозил сперму до – 79 ⁰С выдерживал пакеты со спермой на поверхности твердой двуокиси углерода (сухого льда). Автор впервые получил потомство при использовании замороженной спермы кролика, барана, быка.

В 1948 г. группа биологов из Кембриджа (Англия) обнаружила криозащитные свойства глицерина.

В 1952 году для глубокого замораживания предложены О₂ и N. Однако от использования кислорода отказались – т.к. он является активным окислителем. В нашей практике применяется жидкий азот.

В практике используют следующие виды расфасовки спермы:

- гранулы: облицованные;

- не облицованные.

- соломинки (пайеты).

Для глубокого замораживания в гранулах используют свежеполученную сперму, (быка) которая имеет активность не менее 8, концентрацию – 0,8 млрд. в мл.

Разбавляют синтетической средой:

Вода дистиллированная, мл. – 100

Лактоза или сахароза, г. – 11,5

Желток куриного яйца, мл. – 20

Глицерина, мл – 5,0

Спермосан, тыс. ЕД – 75

Среда подогрета до t –36 ⁰С

Затем сперму эквилибрируют постепенно охлаждают 30 мин – до комнатной t -+ 18 ⁰С, 4-5 часов до t -+ 5-0 ⁰С. Это необходимо чтобы сперма адаптировалась к условиям внешней среды. Замораживание идет двух моментно. Сначала используют Г-Ц-Ж, а через 3 часа в процессе эквилибрации подслаиваем тотже Г-Ц-Ж + глицерин. После эквилибрации (уравновешивания) проверяют активность спермиев (не ниже 7 баллов).

Для замораживания в гранулах применяют термоизоляционный сосуд из нержавеющей стали и фторопластовые пластины с лунками по 0,2 и 0,5 мл.

 

- в канистры и сосуд Дьюара.

 

 

Облицованные гранулы – для этого используют тонкостенную полимерную трубку диаметром 3,8-4 мм.

Её стерилизуют УФО. Заполненную спермой трубку подводят к сварочному аппарату, нарезают, маркируют (объем 0,25-0,33 мл).

 

 

Наиболее перспективная технология замораживания и фасовки спермы разработана в 1975 году Л.Кассу (Франция), который предложил применять полипропиленовые соломинки (пайетты) емкостью по 0,2 –0,4 мл.

Синтетическая среда – Лецифос 271 двух фракций

I. Вначале берут фракцию I (состоянию из лецифос 271, 3 % глицерина, 10 % желтка) эквилибрируют.

II. Фракция II – лецифос – 271, 11% глицерина, 10 – желтка глубокая заморозка в жидком азоте при - 196 ⁰С. После заморозки пайетты собирают в габлеты, а затем в канистры.

Замораживание спермы производителей других с.-х. животных

- Баранов. Разработал Лапырин (совместно с Логиновой, Кузнецовым) присвоено звание Героя Соц. Труда. Технология в основном та, что и для быков. Особенность: более высокое осмотическое давление. Состав разбавителя: Н₂О дист. –100, цитрат Nа –2, глюкоза – 6,0, желток– 20 мл, глицерин–9 мл.

Активность после размораживания – 5 баллов, оплодотворяемость невысокая.

– Жеребцов – в 1956 г. профессор Канкин и аспирантка Ильинская. В 1968 – США. Наиболее удачная технология разработана Платоновым. Сперму центрифугируют в течении 10 мин. – 1200 об/мин.

Состав разбавителя: Н₂О дист. –100, Nа двууглекислый –8 мг, лактоза – 11г., натрий лимоннокислый­ – 89 мг, хелатон – 100 мг, желток– 1,6 мл, глицерин–3,5 мл, спермосан – 25 тыс. ЕД.

Эквилибрация идет 2 часа. Фасуют в пакеты из фальги по 25 мл. Замораживают в парах жидкого азота в течении 5-7 мин. Если морозят гранулы но объем их 0,2 мл (125-150 гранул) в пакет – 25 мл доза на осеменение.

Хряков – замораживают, но глицерина добавляют на 7-8 % больше. Оплодотворяемость низкая.

 

5. Правила транспортировки спермы

В настоящее время сперму хранят в жидком азоте при t–196⁰C. Для хранения и транспортировки глубокозамороженной спермы используют сосуды Дьюара. Они бывают разной ёмкости – от стакана до 50 т. Изготавливают их из нержавеющей стали, стекла, аллюминия. Конструкция – разная, но в основе двустенная колба с выкаченным воздухом из межстенного пространства, или теплоизоляционный материал.

 

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СОСУДОВ

 

Параметры	СДС-6М	СДС-6-2	СДС-35М	СДСТ-35М	СДП-35/60	СДП-35/90
Вместимость, л
Потери жидкого азота от испарения, г/ч	4.4	7,0	3,9	5,9	6,5	8,0
Время полного испарения азота, сутки
Диаметр горловины, мм
Масса порожнего сосуда, кг	6,5	6,0
Количество канистр, штук					-	-

Сосуды различают:

а) портативные – используют на фермах, их можно переносить.

б) стационарные – от 500-800 л. время хранения до 45-70 дней. Может вместить до 150 тыс. доз.

в) транспортные – устанавливают на машинах, от 300 л. до 7 т.