Носители для иммобилизации ферментов

Методы иммобилизации

 

Известны 2 группы методов иммобилизации ферментов:
- физические, не предполагающие связывания фермента с носителем ковалентными связями;
- химические, при использовании которых между ферментом и носителем образуются ковалентные связи.

Физические методы

Самым старым способом иммобилизации является физическая адсорбция. Впервые в 1916 году Нельсон и Грифин адсорбировали фермент - инвертазу на активированном угле и геле гидроксида алюминия. В основе этого способа - физическое или ионное взаимодействие фермента с носителем, который может быть неорганическим (кремнезем, пористое стекло, природные алюмосикаты, оксиды алюминия или титана и др.) или органическим веществом (полисахариды, коллаген, ионообменные смолы и др.). Проведение адсорбции очень простой процесс и заключается в контакте водного раствора фермента с носителем и отмывке не адсорбированного фермента. Более удобным способом является колоночный, когда раствор фермента прокачивают через колонку с носителем и последующее отмывание проводят в этой же колонке. В 1969 году в лаборатории Чибата (Япония) впервые была разработана технология и получена первая партия иммобилизованного фермента - аминооксидазы, расщепляющей ацетил - аминокислоты. Преимущества адсорбционной иммобилизации - простота методики, доступность и дешевизна сорбентов, возможность придания им любой формы. Недостаток - десорбция и ее последствия. Это связано с тем, что сорбция обратима, она зависит от рН и ионной силы раствора, температуры, удельной поверхности и пористости носителя, концентрации субстрата и т.д.

Для уменьшения степени десорбции иммобилизацию проводят:
а) на носителе, модифицированном обработкой ионами Ме, различными функциональными группами, ковалентной пришивкой молекул, являющихся специфическими лигандами для иммобилизованных ферментов и др.;
б) с ферментом, до иммобилизации модифицированном введением ионогенных или гидрофобных групп;
в) с использованием бифункциональных агентов, нейлоновых сеток и т.д.

Недостатков адсорбции удается избежать при иммобилизации ферментов в поры геля. Это тоже физический метод, заключающийся в том, что энзим как бы погружают в матрицу геля, отделяющего его от субстрата полупроницаемой оболочкой. Методически такая процедура выполняется различными способами:
1. Готовый полимерный гель пропитывают раствором фермента. Так как этот способ требует много времени, а полученный препарат обладает низкой удельной активностью, он применяется редко.
2. Фермент вносят в раствор мономеров до проведения их полимеризации.
3. Фермент вносят в раствор готового полимера до его перехода в гель.

Гели, используемые для иммобилизации ферментов, содержат 50-90% воды, заполняющей пространство между полимерными цепями. Фермент, заключенный в матрицу геля, не может выйти наружу, во-первых, потому что расстояние между соседними цепями полимера меньше размеров его молекулы и, во-вторых, из-за наличия ионных и водородных связей фермента с носителем.

Для иммобилизации ферментов применяются:
а) несшитые полимерные гели, образующиеся полисахаридами (крахмалом, агар-агаром, альгинатом, каррагинаном и др.) при охлаждении их горячих растворов. Водный раствор фермента вносят в реакционную смесь перед началом гелеобразования. Для повышения механической прочности биокатализатора и снижения вероятности выхода фермента из полимерной матрицы вводят различные сшивки (например, бифункциональные агенты) или электростатические модификаторы (в случае альгината - при помощи ионов кальция, каррагинана - ионов натрия);
б) сшитые полимерные гели, образуемые поливиниловым спиртом (ПВС) или поливинилпирролидоном, в которых при воздействии ультрафиолетового света, гамма-излучения или потока электронов возникают свободные радикалы, при взаимодействии которых образуются ковалентные сшивкам между цепями.

В настоящее время широкое распространение получили сшитые гели на основе производных акриловой кислоты - полиакриламидные гели (ПААГ), которые были впервые использованы в качестве носителей в 1969 году Инманом и Динцисом. Включение фермента проводится на стадии синтеза полимера из мономера - акриламида в присутствии сшивающего агента - метилен-бис-акриламида. Образующийся блок геля с включенными в его матрицу молекулами фермента может быть подвергнут механическому воздействию для получения частичек разной величины и формы (шарики, волокна, пленки и т.д.).

Преимущества ферментов, включенных в матрицу геля:
1. Фермент практически ни к чему не прикреплен и потому никаких стерических помех не испытывает.
2. Активный центр фермента не блокирован.
3. Фермент надежно защищен от действия бактерий.

Недостатки:
1. Фермент может вымываться из геля.
2. Полимерная матрица может в какой-то мере препятствовать проникновению субстрата в гель, снижая таким образом активность фермента.
3. Метод совершенно неприемлем, когда субстратом является высокомолекулярное соединение.

Другие взаимодействия возникают между носителем, ферментом и субстратом при иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек:
- В 1964 году Т.Чангом был разработан способ иммобилизации - "микрокапсулирование", основанный на создании вокруг капелек ферментного раствора вора полупроницаемых микрокапсул определенных размеров и пористости.
- В 1965 году Т.Чанг предложил метод двойного эмульгирования, заключающийся в том, что эмульсию, полученную при микрокапсулировании, диспергируют повторно в воде. Из капель органического раствора полимера образуется водная эмульсия, содержащая еще более мелкие капли водного раствора фермента. При затвердевании органического раствора образуются полимерные сферические частицы, внутри которых заключены молекулы ферментов. В 1972 году С.Мэй и Н.Ли предложили вместо отвердевающего полимера использовать высокомолекулярные жидкие мембраны из углеводородов.
- В 1972 году Д.Динелли предложил способ иммобилизации фермента в волокна, заключающийся в том, что водный раствор фермента, эмульгированный в органическом растворе волокнообразующего полимера (полихлорвинила или триацетата целлюлозы), продавливают через фильтры в жидкость, вызывающую коагуляцию полимера, например, толуол. Образующиеся при этом полимерные, волокнистые, пористые нити содержат капли водного раствора фермента. Они механически прочны и могут использоваться для изготовления тканей, обладающих ферментативной активностью. При иммобилизации соответствующего фермента такие ткани могут использоваться при лечении ожогов, раневых поверхностей и др.
- В 1975 году Дж.Сесса и Дж.Вайсман впервые использовали метод включения ферментов в липосомы. Липосомы - это концентрические сферы из двойных фосфолипидных слоев. Липосомы с включенными в них препаратами используют в медицине для введения некоторых лекарств и в фундаментальных исследованиях в качестве системы, имитирующей клетки. Все методы с использованием полупроницаемых оболочек просты, универсальны и позволяют получать различные формы иммобилизованного биокатализатора - капсулы, волокна, шарики и т.п. При этом ферменты достаточно стабильны, их активность не ограничивается явлении диффузии, а деградация под действием микроорганизмов исключается. Как и для ферментов, заключенных в гелевую матрицу, использование высокомолекулярного субстрата не представляется возможным, вследствие того, что он не сможет пройти через полупроницаемую мембрану носителя.

Химические методы

При использовании химических методов иммобилизации между ферментами и носителем возникают ковалентные связи. В качестве носителей выступает неограниченный набор природных или синтетических материалов различного молекулярного веса.

Ковалентные связи образуются за счет того, что ферменты, являясь веществами белковой природы, содержат на поверхности молекулы различные функциональные группы: гидроксильные, карбоксильные, тиоловые, амино-, имидазольные, гуанидиновые и т.д. Самые реакционные - это SH-группы, принимающие участие в реакциях окисления, ацилирования, алкилирования и др. Эти группы играют большую роль в стабилизации белка-фермента при помощи дисульфидных мостиков. Так как сульфгидрильные группы входят в активный центр многих ферментов, их не используют для иммобилизации, а, напротив, защищают.

В качестве группы - мишени при химической иммобилизации чаще всего используют высокореакционные аминогруппы белка, которых достаточно много и роль которых в поддержании структуры фермента второстепенна.

В некоторых случаях процесс иммобилизации протекает с участием третьего участника - сшивающего агента (би- или полифункциональный реагент) с образованием следующих конструкций:
носитель-фермент "пришивка"
сшивка-фермент "вшивка"
носитель-сшивка-фермент "сшивка"

Пришивка методически осуществляется таким же образом как адсорбция, т.е. фермент и носитель смешиваются, в результате чего фермент адсорбируется на поверхности носителя. Но, в отличие от простой адсорбции, при химической иммобилизации между функциональными группами на поверхностях фермента и носителя образуются ковалентные связи, за счет которых фермент пришивается к носителю.

Вшивка или ретикуляция ферментов в различные типы сеток осуществляется при помощи сшивающих агентов, от природы и количества которых зависит растворимость образующихся сетчатых структур, узлами в которых служат молекулы ферментов. Фактически, в этом случае фермент сам является носителем.

Если тесное взаимодействие фермента с носителем нежелательно, т.к. ограничивает стерические и диффузионные процессы, то его можно предотвратить при помощи сшивающих молекул различной длины (“сшивка”).

Таким образом, ковалентная иммобилизация ферментов позволяет получать препараты с заданными и контролируемыми свойствами. Но, вследствие дороговизны и сложности их получения, необходимости в обязательной защите активного центра энзима и т.д., этот метод используется, в основном, в лабораторной практике. В крупномасштабных производствах предпочтительна физическая иммобилизация.

Выбор носителя и метода иммобилизации для каждого конкретного случая носит эмпирический характер и может контролироваться только экспериментально.

 

Механические методы

Механические методы иммобилизации основаны на включении микробных клеток в различные гели и мембраны. При включении в гели клетки оказываются заключенными в ячейки полимерной сетки, проницаемой для субстрата, ноне для самих клеток. Как и в случае ферментов, процедуру включения проводят либо в процессе реакции полимеризации (ПААГ), либо при гелеобразовании раствора полимера (альгинат, каррагинан и др.), либо пропитывая готовый блок геля клеточной суспензией.

Наиболее универсальным и широко используемым методом иммобилизации клеток является включение их в ПААГ, которое при любом способе гарантирует равномерное распределение клеток по внешнему объему носителя. Обычно применяют гель в виде гранул, полученных механическим дроблением через сито с ячейками необходимого размера. Его преимущества - это простота приготовления, относительная дешевизна, возможность включать клетки любого размера в любом количестве, достаточная фиксация клеток, прочность гранул на истирание, инертность по отношению к действию микроорганизмов.

Известны примеры включения в гель, образованный производными циркония. Но, поскольку процесс гелеобразования протекает при рН 2-5, такие носители применимы лишь для кислотоустойчивых бактерий.

Японскими учеными предложен способ иммобилизации клеток в каррагинановый гель. Каррагинан - полисахарид, в процессе гелеобразования участвуют одновалентные ионы металлов.

Примером "мягкой" иммобилизации является включение клеток в альгинатные гели. Такой взгляд основан на том, что альгинат- природный полисахарид, выделенный из морских водорослей и состоящий из остатков Д-маннуроновой кислоты, индифферентен по отношению к микроорганизмам, т.к. основан на образовании ионных связей между линейным полиэлектролитом(альгинатом натрия) и поливалентным противоионом (обычно ионы кальция) и протекает при достаточно низких температурах.

Клетки, включенные в полисахаридные гели, сохраняют жизнеспособность в течение длительного времени и в питательной среде могут размножаться в поверхностных слоях полимера. Способность этих гелей к растворению дает возможность вести количественный учет клеток, находящихся в ячейках. Недостатком является то, что большинство полисахаридных гелей демонстрируют низкую механическую прочность.

Клетки микроорганизмов включают в другие гели- поливиниловый спирт, триацетат, жидкостные мембраны и т.д.

Клетки микроорганизмов, включенные в различные гели нашли применение в биотехнологии:

В ИФБМ РАН с 1972 г. ведутся работы по использованию иммобилизованных клеток A.globiformis для трансформации стероидов. Сравнение 10 различных методов выявило, что лучшие результаты дает включение в ПААГ и крупнопористые носители. Период полужизни ферментативной активности составил 5 месяцев. С 1974 года фирма "Танабэ Сейяко" (Япония) приступила к промышленному выпуску яблочной кислоты с использованием включенных в ПААГ клеток Brevibacterium ammoniagenes. В 1978 году ПААГ был заменен каррагинаном, что позволило увеличить эффективность биокатализатора в 2,3 раза, а замена штамма на более активный увеличила этот показатель еще в 5 раз. Это привело к тому, что стало возможным с помощью однократного приготовления гранул получать в непрерывных условиях до 100 т яблочной кислоты. Ферментативная активность иммобилизованных клеток используется для очистки сточных вод, и для извлечения из них тяжелых металлов. Показано, что 10 г клеток Alcaligenes eutrophus (сырая биомасса), иммобилизованных в каррагинановый или альгинатный гели, при очитке сточных вод от трития эквивалентны 1 г платинового катализатора.

 

Физические методы

К физическим методам относятся адсорбция и агрегация. Иммобилизация микробных клеток методом сорбции уже более 100 лет применяется в процессах сбраживания углеводов до этанола, окислениях этанола до ацетата и др. В 40-х годах ХХ века началось использование адсорбированных клеток микроорганизмов для очистки сточных вод, а затем для биологической очистки воздуха, синтеза ценных химических веществ, производства пластмассы, извлечения цветных металлов из бедных руд и др.

В качестве адсорбентов могут быть использованы различные органические и неорганические носители - различные полимеры, керамика, глины. Развитие полимерной химии на современном этапе позволяет обоснованно модифицировать или целенаправленно синтезировать пористые сорбенты с заданной проницаемостью, гидрофильностью и набором определенных функциональных групп на поверхности, отличающиеся высокой химической стойкостью и достаточной для проведения термической стерилизации термостойкостью.

Физические методы иммобилизации основаны на способности клеток слипаться друг с другом или адсорбироваться на подходящих поверхностях. Степень закрепления клеток на носителе зависит от химической природы адсорбента, его формы, характера клеточной поверхности и условий проведения процедур иммобилизации.

Проведя аналогии с иммобилизацией ферментов, многие ученые считали, что физическая сорбция клеток на носителе не может обеспечить ни высокой клеточной нагрузки, ни прочного связывания биологического материала с адсорбентом. Однако, в ряде работ было показано, что при определенных условиях адгезионной иммобилизацией можно практически необратимо сорбировать на 1 г носителя до 1 г влажной биомассы клеток. Причем, даже при высокой скорости потока субстрата клетки удерживаются на поверхности сорбента. В настоящее время в большинстве крупномасштабных микробиологических процессов используются клетки, сорбированные на различных носителях, что связано с такими преимуществами адгезионной иммобилизации, как дешевизна, универсальность, отсутствие стрессовых воздействий на клетки и простота осуществления.

 

 

Носители для иммобилизации ферментов

В качестве носителей для иммобилизованных ферментов могут использоваться различные вещества: природные и синтетические, органические и неорганические, высоко- и низкомолекулярные, но все они должны отвечать следующим требованиям:
- высокая химическая и биологическая стойкость;
- высокая механическая прочность, например, к истираемости;
- возможность получения различных форм - гранул, пластин, мембран, трубочек и т.д.;
- высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность связывания фермента с носителем в водной фазе;
- легкость активации фермента, связанного с носителем;
- способность носителя к максимальной "нагрузке" ферментом, так как высокая концентрация фермента на носителе позволяет уменьшить размеры реактора;
- низкая стоимость.

Органические высокомолекулярные носители по происхождению делят на 2 класса:
1. Природные полимеры.
2. Синтетические полимеры.

Природные полимеры по химической природе подразделяются на белковые, полисахаридные и липидные. Наиболее широко в качестве носителей используются полисахариды, такие как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Их преимуществом являются доступность, наличие различных функциональных групп, высокая степень гидрофильности, недостатком - чувствительность к действию микроорганизмов и высокая стоимость.

Целлюлоза - это поли-бета-глюкопираноза. Отличается высокой степенью гидрофильности и наличием большого количества ОН-групп. Последнее обстоятельство дает возможность получения модифицированных носителей введением различных заместителей. Известны ДЭАЭ-, КИ-, аминоэтил-, бромцианцеллюлоза и др. Механическую прочность целлюлоз повышают частичным гидролизом, разрушающим ее аморфные участки и позволяющим получать гранулированные формы. Недостаток этого носителя - чувствительность к действию кислот, щелочей и окислителей.

Декстран - разветвленный полисахарид, содержащий остатки альфа-глюкозы. На его основе получены такие носители, как сефадексы (Швеция), молселект (Венгрия), образующие в водных растворах сильно набухающие гели, сжимающиеся при высушивании и обладающие высокой химической стойкостью. Легкость биодеградации позволяет применять их в медицине в качестве носителей лекарственных веществ.

Агароза является полимером альфа- и бета- галактозы. На ее основе получены различные марки таких полисахаридных носителей, как сефароза, биогель А и др.

В последние годы в качестве носителей чаще используются природные полисахариды, полученные из морских водорослей - каррагинан, альгиновая кислота и ее соли.

Каррагинан - гетерогенный полисахарид, содержащий, главным образом, эфиры галактозы и серной кислоты. В присутствии моновалентных катионов образует гели.

Альгиновые кислоты и их соли - альгинаты состоят из связанных остатков маннуроновых кислот. В присутствии 2-х валентных катионов, особенно кальция, образуют гели.

Преимущество этих носителей - получение геля при низких температурах, в мягких условиях, недостаток - невысокая механическая прочность.

В работах последних лет сообщается об использовании в качестве носителей хитина и хитозана.

Хитин - природный аминополисахарид, представляющий собой продукт переработки креветок и крабов, в состав наружного скелета которых он входит. По химической природе - это производное целлюлозы, в молекуле которой ОН-группа замещена ацетамидом. Хитин обладает пористой структурой, не растворяется в воде, разбавленных кислотах и щелочах, органических растворителях. Деацилирование его концентрированными растворами щелочей приводит к образованию хитозана, имеющего свободные аминогруппы и растворимого в минеральных кислотах и органических растворителях. Ферменты, иммобилизованные на этом носителе, высокоактивны, термостабильны, устойчивы к бактериальному заражению.

Синтетические полимерные носители для иммобилизации ферментов создаются на основе:
- стирола с использованием сшивающих агентов, например, дивинилбензола. Выпускаются в промышленном масштабе в виде ионнообменников различной пористости под названием "Дауэкс" и "Амберлит".
- акриловой кислоты. Широкое распространение получил полиакриламидный гель (ПААГ), образующийся при сополимеризации акриламида и метилен-бис-акриламида. ПААГ выпускается под названием "биогельР" (США),"акрилекс" (Венгрия) и др. Известны носители смешанного типа на основе ПААГ и агарозы, в которых жесткая матрица создается агаровой, а контролируемая пористость обеспечивается ПААГ. Они выпускаются фирмами "LKB" (Швеция) и "IBF" (Франция) под названием "ультрагель А" в виде водной суспензии сферических гранул.
- поливинилового спирта с глутаровым альдегидом в качестве сшивающего агента. Достоинство этого носителя - возможность введения в его молекулу большого числа различных функциональных групп.
- полиуретана - гидрофильного полимера, обладающего большой стойкостью по отношению к воде и окислителям. Образуется при взаимодействии маоцианатов с полиолами, удобен для включения ферментов, вследствие простоты проведения такой процедуры.
органические низкомолекулярные носители - это либо природные липиды, либо их синтетические аналоги.

Известно, что in vivo большинство ферментативных реакций протекает на поверхности внутриклеточных или клеточных мембран, поэтому модель фермент-липид наиболее приближена к условиям функционирования энзима в клетке. Липидные носители используются в виде монослоев на различных поверхностях или в виде бислоев сферической формы (липосомы). Липосомы впервые были описаны А.Вэнгэмом в 1964 году, для их приготовления в основном используют фосфолипиды. Размер и форма липосом зависят от природы исходного субстрата, способа приготовления, кислотности среды и присутствия неорганических веществ. Простота получения и легкость регенерации иммобилизованного катализатора, возможность использования его in vivo, так как его свойства близки к таковым природных биомембран, способствовали широкому применению липосом в качестве носителей фермента и лекарственных препаратов.

В настоящее время в качестве носителей внедряются синтетические аналоги липидов - поверхностно-активные вещества (ПАВ). Они имеют дифильную природу и содержат неполярную углеводородную часть и полярную головку, от содержания в которой различных функциональных групп различают 4 типа ПАВ: анионные, катионные, неионные и цвиттерионные. Многие из известных ПАВ являются продуктами крупнотоннажного производства, например фирмой "Serva" выпускается более 80 наименований только неионных ПАВ различного строения. Примером использования синтетических аналогов липидов в качестве носителей для иммобилизации являются синтетические моющие средства (СМС), такие как "Ока" и "Био", в состав которых входят смеси ПАВ с протеолитические ферментом.

Неорганические носители - это матрицы на основе силикагеля, глины, керамики, природных минералов и их оксидов. Они могут быть пористыми и непористыми и применяются в виде шариков и монолита. Преимущества этих носителей - легкость регенерации и возможность придания им любой конфигурации.

 

Методы иммобилизации

 

Известны 2 группы методов иммобилизации ферментов:
- физические, не предполагающие связывания фермента с носителем ковалентными связями;
- химические, при использовании которых между ферментом и носителем образуются ковалентные связи.

Физические методы

Самым старым способом иммобилизации является физическая адсорбция. Впервые в 1916 году Нельсон и Грифин адсорбировали фермент - инвертазу на активированном угле и геле гидроксида алюминия. В основе этого способа - физическое или ионное взаимодействие фермента с носителем, который может быть неорганическим (кремнезем, пористое стекло, природные алюмосикаты, оксиды алюминия или титана и др.) или органическим веществом (полисахариды, коллаген, ионообменные смолы и др.). Проведение адсорбции очень простой процесс и заключается в контакте водного раствора фермента с носителем и отмывке не адсорбированного фермента. Более удобным способом является колоночный, когда раствор фермента прокачивают через колонку с носителем и последующее отмывание проводят в этой же колонке. В 1969 году в лаборатории Чибата (Япония) впервые была разработана технология и получена первая партия иммобилизованного фермента - аминооксидазы, расщепляющей ацетил - аминокислоты. Преимущества адсорбционной иммобилизации - простота методики, доступность и дешевизна сорбентов, возможность придания им любой формы. Недостаток - десорбция и ее последствия. Это связано с тем, что сорбция обратима, она зависит от рН и ионной силы раствора, температуры, удельной поверхности и пористости носителя, концентрации субстрата и т.д.

Для уменьшения степени десорбции иммобилизацию проводят:
а) на носителе, модифицированном обработкой ионами Ме, различными функциональными группами, ковалентной пришивкой молекул, являющихся специфическими лигандами для иммобилизованных ферментов и др.;
б) с ферментом, до иммобилизации модифицированном введением ионогенных или гидрофобных групп;
в) с использованием бифункциональных агентов, нейлоновых сеток и т.д.

Недостатков адсорбции удается избежать при иммобилизации ферментов в поры геля. Это тоже физический метод, заключающийся в том, что энзим как бы погружают в матрицу геля, отделяющего его от субстрата полупроницаемой оболочкой. Методически такая процедура выполняется различными способами:
1. Готовый полимерный гель пропитывают раствором фермента. Так как этот способ требует много времени, а полученный препарат обладает низкой удельной активностью, он применяется редко.
2. Фермент вносят в раствор мономеров до проведения их полимеризации.
3. Фермент вносят в раствор готового полимера до его перехода в гель.

Гели, используемые для иммобилизации ферментов, содержат 50-90% воды, заполняющей пространство между полимерными цепями. Фермент, заключенный в матрицу геля, не может выйти наружу, во-первых, потому что расстояние между соседними цепями полимера меньше размеров его молекулы и, во-вторых, из-за наличия ионных и водородных связей фермента с носителем.

Для иммобилизации ферментов применяются:
а) несшитые полимерные гели, образующиеся полисахаридами (крахмалом, агар-агаром, альгинатом, каррагинаном и др.) при охлаждении их горячих растворов. Водный раствор фермента вносят в реакционную смесь перед началом гелеобразования. Для повышения механической прочности биокатализатора и снижения вероятности выхода фермента из полимерной матрицы вводят различные сшивки (например, бифункциональные агенты) или электростатические модификаторы (в случае альгината - при помощи ионов кальция, каррагинана - ионов натрия);
б) сшитые полимерные гели, образуемые поливиниловым спиртом (ПВС) или поливинилпирролидоном, в которых при воздействии ультрафиолетового света, гамма-излучения или потока электронов возникают свободные радикалы, при взаимодействии которых образуются ковалентные сшивкам между цепями.

В настоящее время широкое распространение получили сшитые гели на основе производных акриловой кислоты - полиакриламидные гели (ПААГ), которые были впервые использованы в качестве носителей в 1969 году Инманом и Динцисом. Включение фермента проводится на стадии синтеза полимера из мономера - акриламида в присутствии сшивающего агента - метилен-бис-акриламида. Образующийся блок геля с включенными в его матрицу молекулами фермента может быть подвергнут механическому воздействию для получения частичек разной величины и формы (шарики, волокна, пленки и т.д.).

Преимущества ферментов, включенных в матрицу геля:
1. Фермент практически ни к чему не прикреплен и потому никаких стерических помех не испытывает.
2. Активный центр фермента не блокирован.
3. Фермент надежно защищен от действия бактерий.

Недостатки:
1. Фермент может вымываться из геля.
2. Полимерная матрица может в какой-то мере препятствовать проникновению субстрата в гель, снижая таким образом активность фермента.
3. Метод совершенно неприемлем, когда субстратом является высокомолекулярное соединение.

Другие взаимодействия возникают между носителем, ферментом и субстратом при иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек:
- В 1964 году Т.Чангом был разработан способ иммобилизации - "микрокапсулирование", основанный на создании вокруг капелек ферментного раствора вора полупроницаемых микрокапсул определенных размеров и пористости.
- В 1965 году Т.Чанг предложил метод двойного эмульгирования, заключающийся в том, что эмульсию, полученную при микрокапсулировании, диспергируют повторно в воде. Из капель органического раствора полимера образуется водная эмульсия, содержащая еще более мелкие капли водного раствора фермента. При затвердевании органического раствора образуются полимерные сферические частицы, внутри которых заключены молекулы ферментов. В 1972 году С.Мэй и Н.Ли предложили вместо отвердевающего полимера использовать высокомолекулярные жидкие мембраны из углеводородов.
- В 1972 году Д.Динелли предложил способ иммобилизации фермента в волокна, заключающийся в том, что водный раствор фермента, эмульгированный в органическом растворе волокнообразующего полимера (полихлорвинила или триацетата целлюлозы), продавливают через фильтры в жидкость, вызывающую коагуляцию полимера, например, толуол. Образующиеся при этом полимерные, волокнистые, пористые нити содержат капли водного раствора фермента. Они механически прочны и могут использоваться для изготовления тканей, обладающих ферментативной активностью. При иммобилизации соответствующего фермента такие ткани могут использоваться при лечении ожогов, раневых поверхностей и др.
- В 1975 году Дж.Сесса и Дж.Вайсман впервые использовали метод включения ферментов в липосомы. Липосомы - это концентрические сферы из двойных фосфолипидных слоев. Липосомы с включенными в них препаратами используют в медицине для введения некоторых лекарств и в фундаментальных исследованиях в качестве системы, имитирующей клетки. Все методы с использованием полупроницаемых оболочек просты, универсальны и позволяют получать различные формы иммобилизованного биокатализатора - капсулы, волокна, шарики и т.п. При этом ферменты достаточно стабильны, их активность не ограничивается явлении диффузии, а деградация под действием микроорганизмов исключается. Как и для ферментов, заключенных в гелевую матрицу, использование высокомолекулярного субстрата не представляется возможным, вследствие того, что он не сможет пройти через полупроницаемую мембрану носителя.

Химические методы

При использовании химических методов иммобилизации между ферментами и носителем возникают ковалентные связи. В качестве носителей выступает неограниченный набор природных или синтетических материалов различного молекулярного веса.

Ковалентные связи образуются за счет того, что ферменты, являясь веществами белковой природы, содержат на поверхности молекулы различные функциональные группы: гидроксильные, карбоксильные, тиоловые, амино-, имидазольные, гуанидиновые и т.д. Самые реакционные - это SH-группы, принимающие участие в реакциях окисления, ацилирования, алкилирования и др. Эти группы играют большую роль в стабилизации белка-фермента при помощи дисульфидных мостиков. Так как сульфгидрильные группы входят в активный центр многих ферментов, их не используют для иммобилизации, а, напротив, защищают.

В качестве группы - мишени при химической иммобилизации чаще всего используют высокореакционные аминогруппы белка, которых достаточно много и роль которых в поддержании структуры фермента второстепенна.

В некоторых случаях процесс иммобилизации протекает с участием третьего участника - сшивающего агента (би- или полифункциональный реагент) с образованием следующих конструкций:
носитель-фермент "пришивка"
сшивка-фермент "вшивка"
носитель-сшивка-фермент "сшивка"

Пришивка методически осуществляется таким же образом как адсорбция, т.е. фермент и носитель смешиваются, в результате чего фермент адсорбируется на поверхности носителя. Но, в отличие от простой адсорбции, при химической иммобилизации между функциональными группами на поверхностях фермента и носителя образуются ковалентные связи, за счет которых фермент пришивается к носителю.

Вшивка или ретикуляция ферментов в различные типы сеток осуществляется при помощи сшивающих агентов, от природы и количества которых зависит растворимость образующихся сетчатых структур, узлами в которых служат молекулы ферментов. Фактически, в этом случае фермент сам является носителем.

Если тесное взаимодействие фермента с носителем нежелательно, т.к. ограничивает стерические и диффузионные процессы, то его можно предотвратить при помощи сшивающих молекул различной длины (“сшивка”).

Таким образом, ковалентная иммобилизация ферментов позволяет получать препараты с заданными и контролируемыми свойствами. Но, вследствие дороговизны и сложности их получения, необходимости в обязательной защите активного центра энзима и т.д., этот метод используется, в основном, в лабораторной практике. В крупномасштабных производствах предпочтительна физическая иммобилизация.

Выбор носителя и метода иммобилизации для каждого конкретного случая носит эмпирический характер и может контролироваться только экспериментально.