Приготовление амплификационной смеси и поставка ПЦР.

На одну пробу необходимо:

- 2 мкл 10х ПЦР-буфера;

- 1,5 мкл 2,5 мМ раствора дНТФ;

- 1,5 мкл 25 мМ MgCl₂;

- по 10 pmol каждого праймера (обычно по 0,5-1 мкл).

Для оценки эпидзначимости штаммов используют два праймера для детекции ctx AB:

P1 5¢ - TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG – 3¢

P3 5¢ - GGT ATT CTG CAC ACA AAT CAG - 3¢

-для детекции tcp A:

В реакцию взять эквимолярное количество праймеров. Расчет концентрации провести в зависимости от оптической плотности и количества оснований в олигонуклеотидах по следующей формуле:

C (pmol/m1)= A₂₆₀ / (0,01хN), где:

A₂₆₀ - поглощение раствора праймера при 260 нм;

N - число оснований в одном праймере;

0,2 мкл Taq-ДНК-полимеразы;

стерильной бидистиллированной воды до 22 мкл (в зависимости от количества вносимых праймеров).

Приготовить общую амплифицированную смесь и две пробы (положительный и отрицательные контроли), перемешать пипетированием и внести в амплификационные пробирки по 22 мкл в каждую. Исследуемые образцы в количестве 3 мкл внести в соответствующие пробирки с амплификационной смесью, используя отдельные наконечники для каждого образца, после чего смесь перемешать пипетированием и наслоить 40-50 мкл вазелинового масла (три капли из наконечника объемом 200 мкл).

В качестве положительного контроля применить 3 мкл образца ДНК, экстрагированной методом кипячения из суспензии клеток штамма V.cholerae eltor М-878, с концентрацией 1х10⁷ КОЕ/мл. В качестве отрицательного контроля использовать 3 мкл дистиллированной воды.

Амплификацию проводить в термоциклере по следующей программе:

стартовая денатурация 94 ºС - 2 мин

далее 35 циклов 94 ^оС - 45 сек

57 ^оС - 45 сек

72 ^оС - 45 сек

заключительная элонгация 72 ^оС - 10 мин

Примечания: Солевой ПЦР-буфер, раствор дНТФ, раствор MgCl₂, праймеры, Taq-ДНК-полимеразу хранят при -10 ^оС или -20 ^оС и размораживают (кроме Taq-ДНК-полимеразы) только перед приготовлением амплификационной смеси;

Учет результата амплификации.

По окончании программы амплификации анализируемые образцы смешать с 2-2,5 мкл раствора для нанесения проб и внести в лунки горизонтального агарозного геля плотностью 1,3 %. Электрофорез проводить в 1х ТВЕ-буфере в присутствии бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл, при напряженности 6 В/см в течение 1 ч, не допуская выхода красителя бромфенолового синего из геля. Затем - просмотр геля в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе.

Амплифицированные фрагменты идентифицируют по размеру, сравнивая флюоресцирующие в геле полосы анализируемых образов с полосами положительного контроля или в соответствии с маркерами молекулярного веса.

Оценка результатов:

В случае обнаружения в одной пробе амплифицированных фрагментов размером 777 н.п. (ctxAB оперон), соответствующий штамм расценивается как эпидемически опасный. Проба с отрицательным контролем не должна иметь флюоресцирующих фрагментов в геле.

Занятие 5.

Изучение чувствительности V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor к антибиотикам

· Опредение чувствительности культур к антибиотикам методом диффузии в агаре, используя 18-20-часовую бульонную культуру.

· Определение чувствительности культур к тетрациклину методом серийных разведений в жидкой питательной среде, используя 18-часовую бульонную культуру.

Занятие 6.

Изучение чувствительности V. cholerae cholerae и V. cholerae eltor к антибиотикам

· Учет результата изучения чувствительности культур к антибиотикам по зонам задержки роста вокруг дисков антибиотиков.

· Определение чувствительности (устойчивости) культур к антибиотикам методом диффузии в агаре по таблице 16.

· Учет результата изучения чувствительности культур к тетрациклину методом серийных разведений в жидкой среде. Определение МПК антибиотика в отношении изучаемых культур. Оценка результата по таблице 16.

Занятие 7.