Тема заняття № 3. Дослідження активності ферментів, механізм їх дії та регуляція ферментних процесів.

 

Цілі заняття:

Ø Пояснювати механізм дії ферментів на основі спорідненості ферменту до субстрату та процесів, що протікають у фермент-субстратному комплексі.

Ø Трактувати зміни кількісного визначення активності ферментів як діагностичного показника розвитку певної патології.

Ø Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях.

Ø Аналізувати шляхи та механізми регуляції ферментативних процесів, як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях;

 

 

Теоретичні питання:

1. Принципи кількісного визначення активності ферментів:

· за кількістю продукту, що утворюється під дією ферменту;

· за кількістю субстрату, що використовується;

· за зміною кількості коферменту;

· спектрофотометричні методи визначення активності ферментів;

2. Одиниці ферментативної активності.

3. Основні положення кінетики ферментативного каталізу:

· залежність швидкості реакції від концентрації субстрату;

· утворення фермент-субстратного комплексу та процес перетворення субстрату;

· рівняння Міхаеліса-Ментен;

· смислове значення величини К_m (спорідненість ферменту до субстрату).

4. Механізми дії ферментів (перетворення субстрату):

· ефекти зближення та орієнтації;

· ефекти основно-кислотного каталізу;

· ефекти нуклеофільного та електрофільного каталізу.

6. Активація та інгібування ферментів.

• активатори ферментів;

• інгібування ферментів (зворотне, незворотне, конкурентне, неконкурентне).

7. Основні два принципи регуляції швидкості ферментативних реакцій:

7.1. Регуляція шляхом зміни каталітичної активності ферментів.

• алостеричні ферменти;

• ковалентна модифікація ферментів;

• протеолітична активація ферментів (обмежений протеоліз);

• дія регуляторних білків;

• циклічні нуклеотиди в регуляції ферментативних процесів.

7.2. Регуляція шляхом зміни кількості ферментів.

• конститутивні та адаптивні ферменти.

8. Ізоферменти, множинні молекулярні форми ферментів.

9. Ензимодіагностика, ензмопатії та ензимотерапія.

 

 

Практична робота

Завдання 1. Провести порівняльний аналіз активності холінестерази у різних зразках сироватки крові (титрування розчином NaOH).

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Метод виявлення та кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну. Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Беруть дві пробірки. У першу відміряють 0,5мл сироватки крові №1, у другу– 0,5мл сироватки крові №2. Потім у обидві пробірки з досліджуваними сироватками додають по 2мл 2% розчину ацетилхоліну та інкубують при 37^оС 10 хвилин. Після цього додають по 2 краплі фенолфталеїну і титрують вміст пробірок 0,1М розчином NaOH до слабо рожевого забарвлення.

Кількість лугу, що пішла на титрування, є мірою активності ферменту.

Заповнюють таблицю:

 

Досліджувана сироватка	Кількість 0,1М NaOH, що пішла на титрування, в мл	Висновок
№ 1
№ 2

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне значення. Визначення активності холінестерази сироватки крові використовується для діагностики ряду захворювань, зокрема інфаркту міокарда, вірусного гепатиту, злоякісних пухлин печінки, тощо. Перераховані захворювання супроводжуються значним зниженням активності холінестерази сироватки крові.

У норміактивність холінестеразив сироватці крові становить 44,4 – 94,4 мккат/л (колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду).

Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишківника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібіториацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки – ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.

Завдання 2. Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази.

Принцип методу. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та оцтової кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна псевдохолінестераза, яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін.

Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

Зростання концентрації іонів Са²⁺ в нервовому закінченні є безпосереднім біохімічним сигналом, що активує вихід ацетилхоліну через пресинаптичну мембрану, його взаємодію з холінорецепторами постсинаптичної мембрани та розщеплення медіатора в синоптичній щілині ацетилхолінестеразою. Тому іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом оцтової кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що пішла на титрування є мірою активності ферменту.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

 

Вміст пробірок	№ пробірки
Сироватка крові, мл	0,5	0,5	0,5
Розчин CaCl2, крапель	---		---
Розчин фосфаколу, крапель	---	---
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
Розчин ацетилхоліну –2%, мл	1,5	1,5	1,5
Інкубація 10 хвилин
Фенолфталеїн, крапель
Кількість 0,1М NaOH, що пішла на титрування

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

ВИСНОВОК:

Клініко-діагностичне та практичне значення. Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишечника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібітори ацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки– ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо.

Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.