VII. Генетическая инженерия и конструирование новых организмов-продуцентов.

С помощью методов генетической инженерии можно конструировать по определенному плану новые формы микроорганизмов, способных синтезировать самые различные продукты, в том числе продукты животного и растительного происхождения. При этом следует учитывать высокие скорости роста и продуктивность организмов, их способность к утилизации разнообраз- ных видов сырья. Широкие перспективы перед биотехнологией открывает возможность микробиологического синтеза белков человека. Таким способом получены соматостатин, интерфероны, инсулин, гормон роста. Основные проблемы на пути конструирования новых микроорганизмов-продуцентов сводятся к следующему.

Продукты генов растительного и животного происхождения попадают в чуждую для них внутриклеточную среду, где подвергаются разрушению микробными протеазами. Особенно быстро за несколько минут гидролизуются короткие пептиды типа соматостатина. Стратегия защиты генноинженерных белков в микробной клетке сводится к использованию ингибиторов протеаз; получению интересующего пептида в составе гибридной белковой молекулы (для этого ген пептида сшивают с природным геном организма-реципиента); амплификации – увеличению числа копий генов.

В большинстве случаев продукт трансплантированного гена не высвобождается в культуральную среду и накапливается внутри клетки, что существенно затрудняет его выделение. Так, принятый метод получения инсулина с помощью E.coli предполагает разрушение клеток и последующую очистку инсулина. В связи с этим большое значение придается трансплантации генов, отвечающих за экскрецию белков из клеток. Оправдана также переориентация биотехнологов с излюбленного объекта генетической инженерии E.coli на другие биообъекты (E.coli экскретирует сравнительно мало белков). Кроме того, клеточная стенка этой бактерии содержит токсическое вещество эндокотин, которое необходимо тщательно отделять от продуктов, используемых в фармакологических целях. Как объекты генетической инженерии перспективны поэтому грамположительные бактерии представители родов Bacillus, Staphylococcus, Streptomyces. В частности, B.subtilis выделяет более 50 различных белков в культуральную среду. В их число входят ферменты, инсектициды, а также антибиотики. Перспективны также эукариотические организмы. Они обладают рядом преимуществ, в частности, дрожжевой интерферон синтезируется в гликолизированной форме, как и нативный человеческий белок, в отличие от интерферона, синтезируемого в клетках E.coli. Большинство наследственных признаков кодируется несколькими генами, и генноинженерная разработка должна включать стадии последовательной трансплантации каждого из генов. Примером реа- лизованного многолетнего проекта является создание штамма Pseudomonas sp., способного утилизировать сырую нефть. С помощью плазмид штамм последовательно обогащался генами ферментов, расщепляющих октан, камфору, ксилол, нафталин. К настоящему времени генетическая инженерия освоила все царства живого. Фенотипическое выражение «чужих» генов получено не только у бактерий, но и дрожжей, грибов, растений, животных. Удобными, хорошо изученными и промышленно ценными объектами генетической инженерии служат дрожжи, представители родов Saccharomyces (винные, пекарские, пивные дрожжи), Zymomonas (для получения этанола), Candida, Pichia, Cryptococcus для получения биомассы и микробного белка.

К числу успешных генноинженерных разработок можно отнести введение в дрожжи генов, кодирующих - интерферон, поверхностный антиген вируса гепатита В человека, оперон, отвечающий за азотфиксацию Klebsiellf pneumonia. Ведутся генноинженерные работы с грибами как продуцентами антибиотиков. Генетическая инженерия растений осуществляется на организ- менном, тканевом и клеточном уровнях. Показанная, пусть для немногих видов (томатов, табака, люцерны), возможность регенерации целого организма из одиночной клетки резко повысила интерес к генетической инженерии растений. Однако здесь помимо чисто технических предстоит решить проблемы, связанные с нарушениями структуры генома (изменения плоидности, хромосомные перестройки) культивируемых клеток растений. Примером реализованного генноинженерного проекта является синтез фазеолина – запасного белка фасоли, в регенированных растениях табака. Трансплантация гена, отвечающего за синтез фазеолина, была проведена с использованием Ti-плазмиды в качестве вектора. С помощью Ti-плазмиды трансплантирован также ген устойчивости к антибиотику неомицину в растениях табака, а с помощью CMV-вируса – ген устойчивости к ингибитору дигидро-фолатредуктазы метотрексату в растениях репы. В области генетической инженерии животных клонированы гены -глобина мышей, фага, тирозиновой

РНК E.coli, тимидинкиназы, гуанинфосфорибозилтрансферазы. Помимо почечных клеток зеленой африканской мартышки, излюбленного объекта для манипуляций, в последние годы испытываются все новые культуры клеток, в том числе клетки человека и насекомых, в частности, непарного шелкопряда, где с применением вирусного вектора удалось добиться экспрессии гена -интерферона человека. Этот ген успешно клонирован также в клетках млекопитающих. Клетки млекопитающих растут медленно, на дорогих средах, легко повреждаются различными внешними воздействиями. Однако они необходимы для получения генноинженерных белковых продуктов, идентичных синтезируемым в человеческом организме. Перенос генов в клетки высших животных с помощью вирусов не должен приводить к повреждению клеток, тем более к их лизису, как это наблюдается при обычной вирусной инфекции. При условии снижения вредоносного действия векторов вирусов до безопасного уровня возможны генетические манипуляции с клетками не только in vitro в культуре, но и in vivo в составе целого организма. Вирусы легко распространяются по всему организму, поставляя каждой клетке желаемый ген. В приложении к человеку это могло бы означать лечение наследственных заболеваний, связанных с нехваткой необходимых генов путем заражения больного вирусом, несущим подходящий ген. В генетической инженерии животных и человека, как и в генетической инженерии растений, еще не достигнуто тканеспецифического выражения генов, и решение этой проблемы ищут на путях введения в векторы определенных промоторно-регуляторных участков. Потенциально можно было бы лечить сахарный диабет более радикально, чем сейчас, когда генетическая инженерия поставляет лишь инсулин, синтезируемый E.coli. Можно мечтать о введении в человеческий ор- ганизм вектора с геном инсулина, который будет направлять синтез инсулина только в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы – естественных продуцентах этого гормона.

Отдаленной задачей пока остается применение методов генетической инженерии для улучшения пород сельскохозяйственных животных. Речь идет об увеличении эффективности использования кормов, повышении плодовитости, выхода молока и яиц, улучшении качества мяса. Однако до сих пор не выяснена генетика всех этих признаков сельскохозяйственных животных, что препятствует попыткам генетических манипуляций в этой области.