Реакция адсорбции агглютининов

Если различные бактерии имеют одинаковые или похожие по структуре Аг, то их агглютинируют одни и те же антисыворотки. Для облегчения идентификации таких Аг используют реакцию адсорбции агглютининов, основанную на способности Аг родственных бактерий адсорбировать из сыворотки крови только групповые АТ, сохраняя в ней типоспецифические АТ. Полученные антисыворотки называют монорецепторными, так как они содержат АТ только к одному Аг. Для сорбции агглютининов применяют взвесь убитых бактерий; если они убиты нагреванием, то адсорбируются остающиеся интактыми О-агглютинины, если формалином, то Н-агглютинины [Н-Аг (жгутиковые) не чувствительны к формалину].

Реакция коагглютинации

Она основана на способности белка А золотистого стафилококка неспецифически связывать Fc-фрагменты Ig. В подобных ситуациях стафилококки играют роль частиц с сорбированными на их поверхности АТ. При внесении в систему соответствующих Аг с ними взаимодействуют Fab-фрагменты АТ и образуются агрегаты из стафилококков, диагностических АТ и исследуемых микробных Аг (рис. 10 – 14).

Ы Вёрстка. ВВести рисунок 10–14

Рис. 10 – 14. Схема реакции коагглютинации. Пояснения в тексте.

Пассивные реакции агглютинации

Эти реакции называются непрямыми (пассивными), так как при их проведении используют Аг (или АТ), искусственно сорбированные на поверхности различных корпускулярных частиц.

Реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА, РПГА) — одна из наиболее чувствительных серологических реакций. Основана на способности АТ взаимодействовать с Аг, фиксированными на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. Для большей стабильности диагностикумов эритроциты формалинизируют. Обратная РНГА применяется для выявления Аг в сыворотке крови; для этого на эритроцитах фиксируются не Аг, а АТ. Реакции этого типа широко применяют для диагностики инфекционных болезней, установления беременности, выявления повышенной чувствительности к лекарствам и т.д.

Реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) — дальнейшее развитие РНГА; в некоторым смысле контролирует её специфичность. В отличие от РНГА, включает три компонента: Аг, АТ и Аг (АТ), адсорбированные на эритроцитах. Первоначально Аг реагирует с АТ (стандартная антисыворотка), затем в смесь вносят эритроциты, сенсибилизированные аналогичным Аг (или АТ). Если при взаимодействии Аг с АТ в системе не остаются свободные АТ (или Аг), то агглютинации эритроцитарного диагностикума не наблюдают. Ы ОК! Неясно. Света 12.10.2000

Реакция Кђмбса. Метод выявляет неполные (одновалентные) АТ, образующиеся при бруцеллёзе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Реакция также известна как антиглобулиновый тест. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные (как минимум двухвалентные) АТ. Неполные АТ предварительно инкубируют с корпускулярным Аг и вносят антиглобулиновую сыворотку. Одна молекула полных АТ взаимодействует с двумя молекулами неполных АТ, связавших Аг, в результате происходит видимая агглютинация или гемагглютинация (рис. 10 – 15).

Ы Вёрстка. ВВести рисунок 10–15

Рис. 10 – 15. Выявление неполных АТ (проба Кумбса). Соединение неполных АТ (А) с Аг (Б) не вызывает агглютинации (1). Добавление антиглобулиновой сыворотки (В) приводит к появлению видимой агглютинации (2).

Метод латекс - агглютинации В последние годы ассортимент диагностикумов из убитых микробов дополнили так называемые суспензионные Аг и АТ, сорбированные на различных инертных корпускулярных носителях. Среди них наибольшее распространение нашёл метод латекс-агглютинации, основанный на взаимодействии Аг (или АТ) в образце с частицами латекса, нагруженными специфическими моноклональными АТ (или Аг), что ведёт к быстрому образованию видимых агрегатов. Учёт результатов проводят через 10–15 мин при косом освещении на тёмном фоне. Разработаны коммерческие диагностикумы для выявления Аг Streptococcus pneumoniae, стрептококков группы В, Haemophilus influenzae типа b и капсулированных штаммов менингококка в различных тканевых жидкостях (СМЖ, сыворотке крови, моче). Также имеются наборы для выявления Аг стрептококков группы А в мазках из зева; для первичной экспресс-идентификации колоний стрептококков групп А, В, С, F, энтерококков, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae типов a–f, золотистого стафилококка, Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae.

Реакции преципитации

Реакции преципитации (РП) [от лат. praecipito, осаждать] предложены Краусом (1897) и основаны на фенЏмене образования видимого осадка (преципитата) или общего помутнения среды после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии Аг с АТ. РП ставят в специальных узких пробирках. В качестве реагентов используют гипериммунные преципитирующие сыворотки с высокими титрами АТ к гомологичным Аг. При постановке РП разводят не сыворотку, а Аг. Реакционная среда должна содержать электролиты (физиологический раствор) и иметь нейтральный рН. РП позволяет быстро (в течение нескольких секунд) выявлять незначительные количества Аг. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси Аг. Метод имеет несколько разновидностей (рис. 10 – 16).

Ы Вёрстка. ВВести рисунок 10–16

Рис. 10 – 16. Выявление АГ в реакции преципитации. Схемы реакций кольцепреципитации (А) и диффузии в геле (Б). Пояснения в тексте.

Реакция кольцепреципитации. На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую растворимый Аг, и через несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата (рис. 10 – 16, А). Широкое распространение получила реакция термопреципитации АскЏли на Аг возбудителя сибирской язвы, использующая Аг, экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья. Реакцией кольцепреципитации также выявляют АТ к бруцеллам в молоке (кольцевая проба Банга).

Реакция микропреципитации. Для выявления низких титров АТ (например, при сенсибилизации к ЛС) применяют нефелометрическую реакцию микропреципитации (или реакция помутнения), предложенная УаньЌ (1955). При её постановке в исследуемую сыворотку крови вносят Аг в убывающей концентрациях; при отсутствии АТ разведение сыворотки крови Аг уменьшает её оптическую плотность. Однако в присутствии минимальных количеств АТ образуются микропреципитаты, повышающие оптическую плотность среды.

Реакция флоккуляции [от лат. floccus, хлопья шерсти] — РП в системах токсин-антитоксин и анатоксин-антитоксин, проявляющиеся появлением хлопьевидного осадка или опалесценции при избытке Аг. Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками. Механизм реакции обусловлен растворимостью и авидностью АТ. Реакцию обычно применяют для определения активности антитоксинов.

РП в геле (рис. 10 – 16, Б). Широкое распространение получили модификация РП — РП в геле; методически они отличаются от РП тем, что преципитирующая сыворотка уплотняется добавлением геля (агар, агароза, карбоксиметилцеллюлоза и др.). Известны простая одномерная иммунодиффузия (по Удену), двойная (встречная) одномерная иммунодиффузия, радиальная иммунодиффузия (по МанчЋни) и двойная (встречная) радиальная иммунодиффузия (по ОухтерлЏни). Методы простой диффузии основаны на способности Аг, внесённого в лунки, диффундировать в гель. При постановке реакций двойной диффузии АТ и Аг вносят в отдельные лунки. Обычно методы используют для выявления белковых Аг в различных жидкостях и тканевых экстрактах. Вариантом простой одномерной иммунодиффузии является тест Илека для выявления токсинообразования у возбудителя дифтерии.

Иммуноэлектрофорез. Метод объединяет РП в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло; на его разных краях вырезают две лунки, а в центре — разделяющую их канавку. В лунки вносят смесь Аг и проводят электрофорез в течение 1–2 ч. Различные Аг с разной скоростью перемещаются между катодом («старт») и анодом («финиш»). Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5–7 сут в геле образуются зоны преципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидочёрным). Более информативный и быстрый — метод встречного иммуноэлектрофореза (электросинерез). Его принцип основан на контакте Аг и АТ, обусловленном не их свободной диффузией, а эффектом постоянного электрического поля, усиливающего способность к взаимодействию низкореактогенных Аг и АТ. Основное условие для применения метода — наличие электрофоретической подвижности Аг, отличной от таковой у АТ. Основные достоинства метода — высокая чувствительность, в 10 раз превышающая чувствительность метода двойной иммунодиффузии; возможность идентификации Аг, не выявляемых методом диффузии, и скорость — результаты можно учитывать через 1–3 ч.

Реакции нейтрализации

Реакции нейтрализации (РН) основаны на способности АТ связывать различные возбудители или их метаболиты, лишая тем самым их возможности реализовать свои биологические свойства (иными словами АТ нейтрализуют возбудителей). На практике РН применяют для выявления вирусов и различных токсинов. В определённой степени к ним же относят реакции торможения вирусиндуцированной гемагглютинации и иммобилизации.

РН вирусов (рис. 10 – 17). В сыворотке крови переболевших лиц циркулируют АТ, нейтрализующие вирусы. Их наличие выявляют смешиванием культуры возбудителя с сывороткой с последующим введением лабораторному животному или заражением культуры клеток. На эффективность нейтрализации указывает выживание животного либо отсутствие гибели клеток в культурах.

Ы Вёрстка. ВВести рисунок 10–17

Рис. 10 – 17. Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток. А — отрицательная реакция. Б — положительная реакция.

РН токсинов применяется для идентификации бактериальных экзотоксинов по видовой и типовой их принадлежности, а также для определения содержания антитоксинов в исследуемой сыворотке. Принцип основан на способности антитоксинов связывать токсин и блокировать его действие. Для идентификации токсина и определения титра антитоксических АТ их смесь вводят лабораторным животным. При соответствии типа токсина и антисыворотки гибели животных не наблюдают. Нейтрализацию токсинов in vitro определяют в реакции флоккуляции. Для определения антитоксического иммунитета у человека часто применяют кожные пробы (например, пробу ШЋка).

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Несмотря на своё название, принцип реакции во многом аналогичен РН вирусов, так как основан на способности АТ связывать различные вирусы и нейтрализовать их, лишая возможности агглютинировать эритроциты. Визуально этот эффект и проявляется в «торможении» гемагглютинации. РТГА применяют при диагностике вирусных инфекций для выявления специфических антигемагглютининов и идентификации различных вирусов по их гемагглютининам, проявляющим свойства Аг.

Реакции иммобилизации основаны на способности специфических АТ, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять (нейтрализовать) подвижность различных микроорганизмов. На практике применение нашли реакции иммобилизации бледной трепонемы и холерного вибриона.

Реакции иммунного лизиса. Специфические АТ взаимодействуют с различными клетками, в том числе бактериями и простейшими, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и последующему лизису клеток. Среди реакций иммунного лизиса наиболее известны реакции вибриолиза и реакции гемолиза.

Сложные реакции