Вопрос №17. Общая характеристика плазмид бактерий (фенотипические маркеры, размеры, классификация). Понятие «базового репликона».

Плазмиды определяют как сгабильно наследуемые внехромо- сомные генетические элементы. Они являются обычным компо­нентом бактериальных клеток, но встречаются также и у низших эукариот. В большинстве случаев плазмиды представляют собой суперскрученные ковалентно-замкнутые кольцевые молекулы ДНК длиной от 2 до 600 т.п.н. Благодаря кольцевой структуре они не подвергаются действию экзонуклеаз. Существуют также линей­ные плазмиды, устойчивость которых к действию экзонуклеаз обес­печивается тем, что концы нитей их ДНК защищены белками (Hirochika, Sakaguchi, 1982) или соединяются ковалентно (Свар- чевский, Рыбчин, 1984; рис. 3.1).

Клетки, приобретающие плазмиды, как правило, приобретают и новые признаки. Эти признаки лепи в основу названий обнару­женных впервые плазмид, а именно F-плазмид (фактор пола), при­дающих клеткам донсрные свойства, Col-птазмид, способствующих синтезу колицинов; и R-плазмид, определяющих устойчивость (ре­зистентность) клеток к антибиотикам. Многие свойства плазмид зависят от содержащихся в их сос^г аве транспозонов.

Общие свойства бактериальных плазмид

Реплика щя. Основным свойством плазмид является способ­ность к автономной репликации. Молекулы ДНК приобретают ее в том случае, если в них имеется сайт начала репликации — ori и, как правило, набор генов, необходимых для ее осуществления. Такие молекулы получили название репликонов. Хромосомы про- кариотических клеток содержат по одному о/^-/-сайту, поэтому они относятся к монорепликонным системам. Плазмидные ДНК могут иметь по несколько оп-саитов. Репликоны функционируют лишь тогда, когда в клетках есть все необходимые для этого фермент? т. Клеточные хромосомы включают полный набор генов, кодирую­щих белки рьпликационного комплекса. В нехромосомные же ге­нетические элементы содержат не все необходимые для этого гены, поэтому в их репликации принимают участие и клеточные фер­менты. В большинстве случаев кольцевые плазмиды грамотрица- тельных бактерий реплицируются однонаправленно в тета-форме (закрытое кольцо; рис. 3.2), а грамположительных — в си' ма-форме.

Разл ичают плазмиды со строгим и ослабленным контролем репликации. Минимальный размер плазмид со строгим кон~ролем репликации 20—30 т.п.н., а максимальный — на порядок больше. Плазмиды с ослабленным контролем репликации обычно невели­ки по размеру — не более 15—30 т.п.н.

Строгость контроля репликации плазмид заключается в нали­чии у них механизма ограничения числа копий до 1—3 молекул на клет ку. При этом репликация кольцевых плазмид осуществляется, как празило, клеточными репликативными комплексами (репли- сомами). В клетках Е. coli хромосомный on-сайт (oriC) содержит четыре 9-членных с/яоА-бокса (консенсус ТТАТ(С/А)СА(С/А)), с которыми связывается белок DnaA. Он "плавит" структуру ДНК в ori-сайте и при содействии белка DnaC способствует посадке на этот сайт геликазы DnaB. Образовавшийся комплекс распознается ираймазой DnaG и ДНК-полимеразой III, состоящей из кор-фер- мента DpaF и других субъединиц (Romberg, Baker, 1992), что ини­циирует движение репликационных вилок в обоих направлениях. Плазмиды Е. coli со строгим контролем репликации используют все вышеперечисленные белки, включая инициаторный белок DnaA, для которого в их оп'-сайтах имеются dnaА-боксы. Но основную роль в инициации репликации играют собственные инициаторные белки (Rep-белки), узнающие в плазмидных ои-сайтах специфи­ческие множественные прямые повторы (итероны).

Плазмиды Е. coli с ослабленным контролем репликации для инициации репликации используют РНК-полимеразу и ДНК-поли- меразу I. Элонгацию ведет ДНК-полимераза III. В каждой бакте риальной клетке содержится в среднем 40—50 плазмидных ко­пий, такие плазмиды называют еще мультикопийными. Разница между строгим и ослабленным контролем репликации плазмид особенно заметна, когда клетки переходят из экспоненциальной фазы роста в стационарную. При этом плазмиды со строгим кон­тролем и бактериальная хромосома перестают реплицироваться, в то время как плазмиды с ослабленным контролем продолжают дупликацию, и их масса в клетке может достигать массы бакте­риальной ДНК Аналогичная картина наблюдается и в условиях остановки синтеза белков, например при добавлении в среду хло- рамфеникола. Каждый раунд репликации бактериальной ДНК и плазмид со строгим контролем требует синтеза инициирующих белков, поэтому синтез этих ДНК останавливается. Плазмиды же с ослабленным контролем в таких условиях способны иници­ировать новые раунды репликации, поэтому их число может до­стигать нескольких тысяч на клетку.

Репликация плазмид обоих классов осуществляется в основ­ном бактериальными белками. Поскольку эти белки в клетках разных видов бактерий отличаются друг от друга, то плазмиды поддерживаются только в ограниченном числе близкородственных видов клеток. Известны, однако, примеры плазмид, имеющих широкий круг клеток-хозяев. Такие плазмиды обладают гибкой системой белков, необходимых для их поддержания в различных семействах бактерий.

Интеграция. Плазмиды со строгим контролем репликации спо­собны к интеграции в бактериальную хромосому через IS- или Тп-элементы, содержащиеся в их геноме. При этом они подчиня­ются репликационному аппарату бактериальной хромосомы и мо­гут неопределенно долго существовать в ее составе. Такие плазми­ды с двойным "образом жизни" получили название эписом (например, плазмида F).

Конъюгация. Свойством многих плазмид является их способ­ность передавать свою копию в другие клетки методом конъюга­ции. Плазмиды, обладающие этим свойством, называют конъюга- тивными, или трансмиссибельными; они содержат в своем геноме оперон tra. Этот оперон обеспечивает образование конъюгацион- ного мостика между клетками, по которому может переноситься одна из нитей плазмидной или бактериальной ДНК. Он вызывает также появление у клеток пилей (волосков) определенного типа, способных адсорбировать специфические фаги.

Конъюгативные плазмиды свойственны, главным образом, грамотрицательным бактериям. Они, как правило, имеют доволь­но ограниченное число клеток-хозяев, в которые могут перено­сить и реплицировать свою ДНК. Но среди них есть плазмиды и с широким кругом клеток-хозяев. Например, плазмида RP4, выде­ленная из бактерий Pseudomonas, переносится и стабильно поддер­живается в грамотрицательных клетках Agrobacterium, Azotobacter, Erwinia, Klebsiella, Escherichia, Rhizobium, Rhoclopseudomonas, Salmonella, Shigella и др. Следует подчеркнуть, что такой канал переноса генов между различными видами и родами бактерий спо­собствует адаптации клеток к изменяющимся условиям.

Мобилизация. Многие неконъюгативные плазмиды обладают свойством мобилизации, т. е. способностью переноситься в другие клетки с помощью коныогативной плазмиды. У таких плазмид име­ется специальный локус, обеспечивающий передачу их ДНК через "чужой" конъю) ативный мостик (мобилизация in trans'. Возможен и другой nvTb. Наличие транспозонов в плазмицах способствует их объединению друг с другом, т. е. образованию коинтегратов. Не- конъюгативная плазмида может быть перенесена в другую клетку в составе коинтеграта с конъюгативной плазмидой (мобилизация in cis). Коинтефаты в реципиентных клетках распадаются на исход­ные репликоны, которые продолж нот автономное существование.

Несовместимость. Если плазмиды не могу/ стабильно сосуще­ствовать в одной клетке в условиях отсутствия селективного давления, их называют несовместим] гми. Несовместимость плазмид обусловли­вается подавлением репликации одной из них и (или) блокировани­ем распределения дочерних молекул ДНК по клеткам перед их деле­нием. Эти оба механизма действуют незагисимо друг от друга.

Несовместимость, вызванная подавлением репликации, наблгс дается у плазмид как со строгим, так и с ослабленным контролем репликации. Она обусловлена существованием > плазмид генети­ческого механизма поддержания числа плазмидных копий на оп­ределенном уровне, который приводит к тому, что в клетке только одна из двух плазмид (резидентная или с меньшей вероятностью вошедшая) сохраняет способность к удвоению.

Несовместимое' ь, вызванная блокированием распределения дочерних молекул ДНК по клеткам, характерна для низкокопий- ных плазмид. В ее основе лежит факт конкуренции плазмид за сайты на цитоллазматической мембране, обеспечивающие их рас­пределение при делении клеток.

Тест на совместимость позволяет разделять плазмиды на группы несовместимости (табл. 3.1). У Е. coli их насчитывается 6oJ.ee 30. Плазмиды, входящие в одну тру ппу, несовместимы, т. е. исключа­ют друг друга. Несовместимыми могут быть и плазмиды с разным фенотипическим проявлением. Например, в группу F) входят плаз­миды типа F (половой фактор). Col (колициногенность> и R (ус­тойчивость к антибиотикам).

Поверхностное исключение. На практике определение групп несовместимости осложняется явлением поверхностного исключе­ния (surface exclusion), свойственным конъюгативньш плазмидам.

Дело в том, что если в реципиентной клетке уже имеется конъю- гативная плазмида, тс при конъюгации с ней другая плазмидная ДНК проходит через клеточную оболочку с трудом. Частота пере­носа плазмид при этом падает в 10—100 раз по сравнению с тако­вой в бесплазмидные клетки. Плазмиды, преодолевшие этот барь­ер, стабильно сосуществуют с плазмидой-резидентом, если они, конечно, совместимы.

Стабильность. Как и всего живого, главное в "жизни" плаз­мид — это обеспечение своего стабильного существования. Для этого в процессе эволюции у них выработалось несколько меха­низмов: надежный контроль числа копий, точнее распределение плазмидных ДНК пс дочерним клеткам, разрешение коинтегратов и постсегрегационная гибель бесплазмидных клеток (см. обзор No/dstrom, Austin, 1989).

Контроль числа копий осуществляет базовый репли- кон плазмиды (его размер около 2—3 т.п.н), в который входят сайт начала репликации on, сайты контроля за копийностью сор и не­совместимостью тс (incompatioility), а также гены, чьи продукты функционируют на этих сайтах. По механизму контроля процесса репликации базовые репликоны делятся на два типа. В одних реп- ликонах контроле осуществляется с помощью асРНК либо на уров­не праймера репликации в оп'-саите (например, плазмида с ослаб­ленным контролем репликации ColEl), либо на уровне транскрипта репликационного гена (например, плазмида строгим контролем репликации R1). В репликонах другого типа контролирующий бе­лок выполняет свою функцию, взаимодействуя с итеронами, при­сутствующими в сайтах сор и inc (например, плазмиды со строгим контролем репликации F и Р1). В обоих случаях контролирующий механизм поддерживает заданное число копий плазмиды в клетке. Если, например, в клетке оказались цве родственные малокопий- ные плазмиды, то механизм контрсл> замечает наличие двух гомо­логичных ori- сайтов и разрешает только завершение уже начатого раунда репликации, блокируя инициацию нового. В этом и состоит причина несовместимости таких плазмид.

Термочувствительные мутации в сайте сор позволяют в усло­виях эксперимента регулировать число копий плазмид, имеющих строгий или ослабленный контроль процесса репликации. В ряде случаев полезны мутации (их называют run-away), приводящие при 42 °С к синтезу более 2000 копий плазмид на клетку и вызы­вающие гибель клеток (см гл. ]0).

Механизм распределения плазмидных ДНК по дочерним клеткам, как уже отмеча дось, является еще одной причиной несовместимости у малокопийных плазмид. Необходи­мость такого механизма для этих плазмид очевидна, так как веро­ятность их потери при случайном распределении по делящимся клеткам очень велика. Сегрегация бееллазмидных клеток ведет к их накапливанию в клеточной популяции из-за большей скорости их удвоения по сравнению с клетками, содержащими плазмиды. Еще более сложна эта проблема для бактериальных клеток. У них выработался специальный механизм ее решения (см. обзор Hiraga, 1992), суть которого заключается в связывании дочерних ДНК с помощью специального белка со специфическими сайта­ми на цитоплазматической мембране, направляющими расхож­дение ДНК при делении клеток. Сходный механизм использу­ют и плазмиды, но у них для этого есть собственные белки Par (partition) и свой сайт на мембране, а также предназначенный для связывания сайт на плазмидной ДНК (рис. 3.3). Предполагается,что для белков Par определенной плазмиды на мембране имеется только один сайт, поэтому с ним может связаться лишь одна пара разделяющихся молекул ДНК. Следовательно, плазмиды, имею­щие одинаковые или сходные гены par, несовместимы.

Мультикопийные плазмиды распределяются по дочерним клет­кам случайным образом. Казалось, это не должно вызывать серьез­ных проблем, так как уже при числе копий более 10 вероятность сегрегации бесплазмидных клеток менее 10⁶. Однако известно, что у плазмид благодаря гомологической рекомбинации могут образовы­ваться коинтеграты, содержащие несколько плазмидных геномов. Это свойство плазмид приводит к уменьшению числа плазмидных репликонов в клетке и грозит вызвать их дестабилизацию. В данном слу­чае стабильность плазмид поддерживается механизмом разре­шения коинтегратов.Он обеспечивается сайт-специфической рекомбинацией между геномами, входящими в коинтеграты, в резуль­тате чего они распадаются на моногеномные репликоны (рис. 3.4).

Своеобразным способом стабилизации популяции клеток, со­держащих некоторые плазмиды, является тостсегрегационная гибель бесплазмидных бактерий. Это явление основано на гом, что такие плазмиды синтезируют одновременно ядовитое для клеток вещество и противоядие к нем>. Яд стоек, а противо­ядие нестойко, поэтому необходим его постоянный синтез, что возможно только в присутствии плазмиды. В клетках, потерявших плазмиду, яд демаскируется и убивает клерки (рис. 3.5). Яд пред­ставляет собой белок, имеющий разные мишени у различных плаз­мид, а противоядие — либо также белок, либо сРНК, действую­щая претив транскрипта "ядовитого" гена.

Фенотипические признака 1 Глазмиды придают клеткам различ­ные фенотипические признаки: устойчивость к антибиотикам (ам­пициллину, тетрациклину, хлорамфениколу и т. д.; всего более 20), катионам (висмута, кадмия, кобаль~а, ртути, свинца, сурьмы), ани­онам (арсенату, арсениту), мутагенам (акридинам, этидиум-броми- ду, УФ-свету), бактериоцинам. Клетки с плазмидами способны: вызывать биодеградацию камфоры, ксилсла, нафталина, никотин-ни- кстината, n-алканов, салицилата, толуола; синтезировать антибио­тики, бактериоцины, гемолизин, инсектициды, пигменты, поверхно­стные антигены, сероводород, токсины, фибринолизин; ист шьзочать в качестве источника углерода различные сахара и необычные ами­нокислоты; конъюгировать с реципиентны] ш штаммами бактерий; индуцирозать опухоли у растений; осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК. Плазмиды, которые не выявляются по фено- типическим признакам, называют криптичесхими

Итак, основными биологическими свойствами плазмид являют­ся их способность к репликации, конъюгативность, интегрируемость, несовместимость, стабильность и фенотипические признаки, кото­рые они придают бактериям. Рассмотрим, как эти свойства обуслов­ливаются генетическими особенностями плазмиды F, а также неко­торых наиболее изученных представителей семейств R- и Со1-плазмид.

Базовый репликон -Mинимальный участок плазмиды, достаточный для ее стабильного существования в бактериальной клетке, т.е. включающий набор генов несовместимости плазмид, контроля числа копий, репликации и сегрегации.