Основные положения иммунобиотехнологии лекарственных средств

Форма проведения лекции: проблемная

План лекции

1. Основные положения иммунологии. Иммунобиотехнология.

2. Структура и функция антител.

3. Гибридомы, их свойства и получение

 

1. Иммунобиотехнология - это раздел современной биотехно­логии, представленной как научными достижениями, так и ди­намично развивающимся технологическим производством диа­гностических, профилактических и лекарственных средств с при­менением в качестве действующего начала разных агентов и про­цессов иммунной системы. Известно, что человек обладает им­мунной системой для защиты от воздействия внешних неблаго­приятных факторов, биологически активных агентов. В качестве таких агентов выступают клетки микроорганизмов, вирусы, бел­ки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, пестициды, объединен­ные под общим названием антигенов. Понятие «антиген» является общим, так как обозначает определенную химическую структуру, против которой могут быть получены антитела.

На самом деле антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получившим название антигенных детерми­нант (эпитопов). Например, в случае белковых молекул антиген­ными детерминантами являются участки поверхности, содержа­щие всего около пяти аминокислотных остатков. В случае бактери­альных клеток в качестве антигенных детерминант часто выступа­ют короткие цепочки из трех —пяти остатков cахаров, образу­ющих стенку бактерий.

Что касается низкомолекулярных соединений, например не­которых лекарств, то сами по себе они не могут вызывать образо­вание антител. Их называют гаптенами. Однако после присоедине­ния гаптенов к поверхности какой-либо макромолекулы организм начинает вырабатывать антитела. Причем даже малые размеры гап-тена по отношению к объему полости активного центра антитела не являются препятствием для образования высокоспецифических антител, хотя гаптен в этом случае связывается лишь с частью специфических участков активного центра антитела. В качестве примера можно привести молекулы двух гормонов — тироксина и тиронина, структура которых отличается всего лишь одним ато­мом йода, а вырабатываемые антитела против них разнятся по константам связывания более чем в 1 000 раз.

Антигены внешней среды поступают в организм человека с воздухом, водой, пищей, через слизистые и кожные покровы. Часть антигенов может попадать к человеку в виде вакцин и иммуномодулирующих лекарственных средств (агентов). Иммуномодуляторы либо усиливают, либо ослабляют иммунный ответ организма, поэтому в зависимости от свойств их подразделяют на иммуностимуляторы и иммуносупрессоры. Иммунный ответ сложный процесс межклеточного взаимодействия лимфоидных клеток разных типов с участием специфических гормонов, в ре­зультате чего так называемые В-клетки активно синтезируют специфические антитела против данного антигена. Антитела, однородные по структуре и специфичности, производимые в неограниченных количествах, называются моноклональными антителами.

2. Способы усиления иммунного ответа по типу воздействия под­разделяют на активные и пассивные, последние — на специфи­ческие и неспецифические (табл. 8).

К группе активных специфических препаратов можно отнести вакцины, полученные на основе либо рекомбинантных, протективных антигенов, либо живых гибридных носителей. К группе препаратов для образования пассивного иммунитета (неспецифи­ческой иммуностимуляции) относят рекомбинантные интерлейкины, интерфероны и другие цитокины.

Вместе с тем существует группа препаратов с иммуносупрессивной активностью, появление которых в клинической практи­ке в 1960-х гг. было связано с необходимостью подавления реак­ции отторжения тканей при трансплантации органов и лечения аутоиммунных заболеваний (табл. 9).

 

Таблица 8

Способы усиления иммунного ответа с помощью иммунобиопрепаратов

 

Активное воздействие	Пассивное воздействие
специфическое	неспецифическое
Вакцины на основе рекомбинантных протективных анти­генов, живые гиб­ридные носители	Поликлональные антитела — на инфекционных агентов, микроб­ных токсинов	Рекомбинантные интерлейкины, интерфероны и другие цитокины. Тимические факторы. Транс­плантация костного мозга.

 

Таблица 9

Способы супрессии иммунного ответа с помощью иммунобиопрепаратов

 

Специфическое воздействие	Неспецифическое воздействие
активное	пассивное
Рекомбинантные антигены, IgE-связующие молекулы и созданные на их основе толерогены	Иммунотокси- ны, антиидиоти-пические антитела в качестве мишени для аутоантител. Специфичес-кая плазмо-иммуносорб-ция	Моноклональные антитела против цитокинов. Неспецифическая гемосорбция и иммуноплазмофорез

 

Как видно из табл. 9, к препаратам, вызывающим супрессию специфического иммунного ответа к какому-либо аутоантигену относятся толерогены. Их получают, конструируя комплекс из рекомбинантных антигенов и неиммуногенных носителей, подавляющий специфический LgE-ответ на аллерген. При коньюгации цитостатика или токсина с антителами (иммунотоксинами) можно осуществить направленный транспорт лекарственного средства к определенному рецептору клетки, к конкретной субпопуляции клеток, например к Т-лимфоцитам (Т-хелперам). Кроме того, антиидиотипические антитела (образующиеся против антиген-связывающих центров) могут быть мишенью для аутоантител, с помощью которых можно влиять на течение аутоиммунного за­болевания, нивелируя его симптомы, корректируя, например, на­рушения системы свертывания крови и т.д.

Методы пассивной иммуносупрессии включают специфическую плазмоиммуносорбцию, которая используется при тяжелых фор­мах аллергических заболеваний. С помощью этого метода можно удалять из крови больного глобулины и аллергеноспецифические антитела.

В современной фармацевтической биотехнологии кроме иммуномодуляторов и иммуносупрессоров значительное место отво­дится лекарственным и диагностическим препаратам, получае­мым на основе медиаторов иммунной системы.

3. Медиаторы иммунологических процессов, являющиеся в обоб­щенном виде полипептидными факторами неиммуноглобулиновой природы, называются цитокинами. Белки, синтезируемые лимфоцитами, называют лимфокинами, а синтезируемые макро­фагами и моноцитами — монокинами. Иммуномедиаторы — это единая функциональная совокупность, обеспечивающая в гомео-стазе созревание и дифференцировку Т- и В-клеток путем регу­лирования их пролиферативной активности. Как правило, коли­чество медиаторов в организме невелико и они быстро инактивируются. С помощью биоинженерии удалось решить проблему получения интерлейкина-1 и -2 для группы Т-клеточных лимфокинов, а также медиаторов семейства интерферонов.

Показанием к терапии служит эндогенный дефицит интерлей-кина-2, возникающий, например, после трансплантации костно­го мозга, а также при цитостатической терапии. В настоящее вре­мя методами генной инженерии можно получать препараты ин­терферонов всех классов, положительные результаты применения которых были получены при лечении вирусных заболеваний и отдельных видов опухолей (в онкологии).

 

Контрольные вопросы

 

1. Важные области использования методов иммунобиотехнологии.

2. Области применения гибридом.

3. Метод гибридомной технологии.

 

Лекция 29

Моноклональные антитела, области применения

Форма проведения лекции: проблемная

План лекции

1. Моноклональные антитела.

2. Области применения моноклональных антител – медицинская и ветеринарная диагностика, терапия.

 

1. Лекарственные вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток), зачастую оказываются значительно менее эффективными in vivo. Кажущее­ся снижение их активности объясняется тем, что они не достига­ют органа или клетки-мишени в нужной концентрации. Увеличе­ние дозы принимаемого препарата не решает проблему, посколь­ку при этом часто возникают побочные эффекты. Более того, что­бы избежать этих эффектов, многие терапевтические средства за­ведомо вводят в дозах, не достигающих оптимальных, что допол­нительно снижает их эффективность. Для облегчения доставки лекарственного вещества к месту его действия используют несколь­ко приемов:

· заключают его в липосомы, липидная оболочка которых име­ет высокое сродство к нужным органам;

· встраивают гены специфических токсинов в инфильтруюшие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непо­средственно в опухоли;

· присоединяют молекулы лекарственных веществ к моноклональным антителам, специфичным по отношению к белкам, на­
ходящимся на поверхности строго определенных клеток, напри­
мер опухолевых (рис. 9, а);

· используют лекарственные вещества в неактивной форме,
переводя их в активное состояние при помощи ферментов. Чтобы
такое превращение происходило только вблизи клетки-мишени,
фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфич­
ному к поверхностному антигену этой клетки (рис. 9, б).

 

Рис. 9. Использование моноклональных антител для целевой доставки лекарствен­ных веществ:

1-лекарственное вещество;

2-инертная форма лекарственного вещества;

3-моноклональное антитело; 4-фермент;

5-поверхностный белок; 6-клетка-мишень

 

Несмотря на весьма существенные достижения применения моноклональных антител в терапии разных заболеваний, имеют­ся все-таки и некоторые ограничения их использования в клини­ках. Прежде всего они как гибридомные продукты могут быть контаминированы генетическим материалом ретровирусов, так как все миеломы как опухолевые партнеры гибридизации имеют в геноме гены ретровирусов, являющиеся онкогенными и соответ­ственно опасными для человека. Поэтому все препараты моно­клональных антител обязательно тестируются на отсутствие ви­русного генетического материала.

Для получения антител используют мышей, морских свинок, кроликов, кур, овец, коз, лошадей, которым делают инъекции антигена. В присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыво­ротке крови накапливаются специфические антитела. Обычно ан­титела выделяют из сыворотки крови сульфатом аммония, спир­том или полиэтиленгликолем. Эти антитела имеют много приме­сей белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной и аффинной хроматографии на иммуносорбентах.

Для организации масштабного производства моноклональных антител ключевую роль сыграл метод гибридомной технологии. Хорошо известно, что в результате иммунного ответа на какой-либо антиген образуется высокогетерогенный продукт — анти­сыворотка со смесью антител, продуцируемых разными линиями В-лимфоцитов и направленных к разным антигенным детерми­нантам антигена. Проблема получения определенной линии лим­фоцитов, которые не растут на искусственной среде in vitro в куль­туре, была решена, как только стало возможным получение со­матических гибридов. Известно, что миеломы (злокачественные опухоли костного мозга, клетки которых обладают способностью к неограниченному росту) продуцируют большое количество ано­мальных иммуноглобулинов.

В 1975 г. Г. Келер и К. Мильштейн сумели впервые выделить кло­ны клеток, способные секретировать только один тип молекул антител и в то же время расти в культуре. Эти клоны клеток были получены слиянием антителообразующих и опухолевых клеток — клеток-химер, названных гибридомами, так как, с одной сторо­ны, они наследовали способность к практически неограниченно­му росту в культуре, а с другой стороны, способность к продук­ции антител определенной специфичности (моноклональных ан­тител).

Весьма существенно для биотехнолога то, что отобранные клоны могут длительно храниться в замороженном состоянии, поэтому в случае необходимости можно взять определенную дозу такого клона и ввести животному, у которого будет развиваться опухоль, продуцирующая моноклональные антитела заданной специфич­ности. Вскоре в сыворотке животного будут обнаружены антитела в очень высокой концентрации от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получать из культуральной жидкости. В настоящее время гибридомная технология получила широкое применение. Созда­ние гибридом, которые можно хранить в замороженном состоя­нии (криоконсервирование), позволило организовать целые гибридомные банки, что в свою очередь открыло большие перспекти­вы по применению моноклональных антител.

2. Сфера их примене­ния помимо количественного определения разных веществ вклю­чает самую разнообразную диагностику, например идентификацию определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов (табл. 10).

Только благодаря использованию моноклональных антител, полученных в результате иммунизации животных лекарствами, стало возможно определение дозы этих лекарств. Такая «иммунодозировка» надежна и экономична. В 1990-х гг. в США «Управле­ние по контролю за качеством пищевых продуктов, медикамен­тов и косметических средств» (FDA) впервые утвердило к продаже коммерческий набор для диагностического скрининга на ос­нове гибридом, предназначенный для установления аллергена.

С помощью моноклональных антител возможно выделение био­логически активных веществ (белков, гормонов, токсинов) из сложных смесей. Например, при использовании иммуноадсорбции для очистки интерферона был получен препарат высочайшей степени очистки (до 99 %). Только после одного пассажа через колонку с иммобилизованными моноклональными антителами препарат очищался в 5 000 раз!

 

Таблица 10

Области применения моноклональных антител

 

Диагностика	Терапия	Технология	Научные исследования
1 Иммунохи мические анализы био-логических жидкостей, клеток орга- низма, мик-рорганизмов, вирусов и т.д. 2. Иммуногис тохимические методы 3. Иммунос-цинтиграфия опухолей. 4. Типирова- ние групп крови и тканей	1. Воздействие на опреде-ленные кле-точные попу-ляции. 2. Влияние на иммунные ре-гуляторные ме-ханизмы с по-мощью антител к лимфокинам 3. Иммуно-регуляция с помощью ан-тиидиотипических антител. 4.Направлен-ный транспорт лекарств с помощью моноклональ-ных антител. 5. Элиминация токсинов, иммуноглобулинов из класса lgE	1.Идентификация молекул. 2. Очистка клеток, несущих специфи-ческий антиген.	1. Исследование этиологии и патогенеза различных заболеваний. 2. Исследование системных и межсистемных механизмов регуляции. 3. Создание новых лекарственных средств и биопрепаратов.

 

Можно использовать моноклональные антитела и в качестве меток для точной идентификации специализированных клеток, например нейронов. Существует также технология использования моноклональных антител для изучения клеточных мембран, по­зволяющая выделять мембранные белки в чистом виде и измерять их биологическую активность. Моноклональные антитела можно использовать как в качестве стандартного реагента для обнаружения определенных молекул на клеточной мембране, так и для разделения популяции клеток, несущих на поверхности разные антигены. Кроме того, с помощью моноклональных антител можно со­здавать высокоспецифичные вакцины, особенно против опреде­ленных вирусных штаммов и паразитов. Моноклональные антите­ла способны также к нейтрализации лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассе­янный склероз, ревматические болезни). В сочетании с лекарствен­ными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клетки-мишени, позволяя избегать серь­езных побочных явлений, весьма обычных, например при химио­терапии рака.

Некоторое время назад считалось, что геном эмбриональных клеток в процессе дифференцировки соматических клеток (ста­дия образования разных тканей организма) не изменяется, а все разнообразие форм и функций дифференцированных клеток от­носится к различиям в экспрессии одних и тех же генов. Однако в дальнейшем было показано, что разнообразие молекул антител, которые образуются зрелыми лимфоцитами, связано с так назы­ваемой «активной перетасовкой» нескольких сотен генов в клет­ках-предшественниках лимфоцитов. Причем именно степень ак­тивности этой «перетасовки» и обусловливает широчайшее раз­нообразие антител.

Было также показано, что рекомбинация ДНК позволяет из­менять геном клетки, направляя ее метаболизм (клеточную спе­циализацию) на увеличение генетического разнообразия. Как из­вестно, молекула антитела является результатом сборки из не­скольких белковых цепей, а синтез любого белка определяется соответствующим геном. Соответственно предполагалось, что дол­жны существовать миллионы генов, кодирующих синтез опреде­ленных молекул антител, вырабатываемых организмом млекопи­тающих.

Однако было установлено, что в геноме клеток последних из сотен тысяч генов только незначительная их часть вызывает син­тез антител в результате того, что так называемые стволовые (эм­бриональные) клетки не содержат полного набора генов всех ан­тител, а обладают лишь набором генетических элементов, кото­рые способны очень быстро перестраиваться в процессе дифференцировки и созревания клеток иммунной системы (В-лимфоцитов), что, собственно, и приводит к образованию миллионов клеточных линий, вырабатывающих разные антитела.

Что касается молекулы самого антитела (иммуноглобулина), то она состоит из двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белко­вых цепей, которые соединены расположенными в строго опре­деленных местах дисульфидными мостиками и водородными свя­зями. Каждая цепь имеет постоянную (константную) и вариабельную области. N-концевые участки (L) и (Н) цепей об­разуют антигенсвязывающий сайт. Отдельные домены (области) молекулы антитела выполняют разные функции, что облегчает манипуляции с генами антител. Антигенсвязывающие сайты со­стоят из трех участков CDR — complementarity-determining regions, определяющих комплементарность антител к антигену и образу­ющих вариабельные (V_H и V_L) области на N-концах (Н) и (L) цепей. Для CDR характерна очень высокая изменчивость последо­вательности аминокислот, поэтому их называют еще гипервариа­бельными.

Легкие цепи идентичны у всех видов животных, а тяжелые цепи представлены пятью типами (ц, 5, у, е и а), которые и определя­ют пять классов иммуноглобулинов, обнаруженных у млекопита­ющих: IgM, IgD, IgG, IgE и IgA.

При контролируемом ферментативном гидролизе иммуногло­булинов образуются фрагменты двух типов: Fab и Fc, причем N-концевая часть Fab фрагмента, называемая F_у-фрагментом, об­ладает антигенсвязывающей активностью, присущей интактной молекуле антитела. Существуют около миллиона разных специфи­ческих антител, что обеспечивает определение практически лю­бых биологически активных веществ как природного, так и син­тетического происхождения. Например, в антителах класса IgM все тяжелые цепи имеют одинаковую постоянную область m, ва­риабельные же области у разных молекул антител различны и отражают их антигенные свойства. Таким образом, константная (постоянная) область тяжелых цепей определяет способ действия антитела в организме: если она, например, d-типа, т.е. антитело принадлежит к классу IgD, то оно является связанным с поверхностью синтезирующей его клетки; если же тяжелая цепь, напри­мер е-типа, то соответствующее антитело IgE может связываться с поверхностью специализированной клетки, способной выде­лять гистамин, что приводит к появлению симптомов астмы или лихорадки, когда антитело взаимодействует с антигеном (напри­мер, с пыльцой какого-либо растения).

Моноклональные антитела с успехом применяются для диф­ференциальной диагностики многих инфекционных и неинфек­ционных заболеваний, а также для стандартизации определения групп крови путем иммунохимического анализа. Именно с помо­щью моноклональных антител были идентифицированы индиви­дуальные маркеры многих возбудителей инфекционных заболева­ний как вирусной, так и бактериальной природы. Изучение гене­тических механизмов многих заболеваний стало возможным бла­годаря уникальной специфичности моноклональных антител. Так, методом иммуносцинтиграфии опухолей можно идентифициро­вать локализацию опухоли с ее метастазами размером 0,5— 1,0 см.

Самыми важными областями использования иммунохимического анализа являются:

· контроль банков крови и продуктов из донорской крови;

· обнаружение возбудителей в объектах внешней среды;

· диагностика инфекционных заболеваний;

· диагностика диабета.

Сегодня количество проводимых иммунохимических анализов в мире растет настолько стремительно, что производство иммунодиагностикумов совместно с приборами и вспомогательными материалами можно рассматривать уже как отдельную, самостоя­тельную область биотехнологической промышленности.

Принципы иммунохимического анализа можно представить реакцией растворимого антигена (АГ) с антителом (AT), зная о двухвалентности AT и поливалентности АГ. Антитело, образуя комплекс с антигеном, обеспечивает уникальное по специфич­ности узнавание определяемого вещества в любых сложных мно­гокомпонентных системах.

Этот процесс описывается системой уравнений двух стадий:

аг + at = агат

агат +ат = агn (ат)

 

Первая стадия характеризует взаимодействие активного цент­ра антител с антигенной детерминантой, которая представляет участок молекулы АГ, способного связываться с активным цент­ром специфического AT. Здесь проявляется свойство AT «склеи­вать» антигены (АГ). Причем размеры антигенных детерминант (эпитопов), например, для белковых антигенов составляют всего несколько аминокислот.

Вторая стадия характеризуется образованием комплексов слож­ного состава, когда двухвалентная молекула AT способна связать­ся лишь с двумя молекулами АГ в комплекс, который в свою очередь может связать еще одно AT и т.д. Образующиеся агрегаты таких комплексов обнаруживаются либо по возникающей мутно­сти раствора, либо по выпадению в осадок.

Такая реакция взаимодействия белковых антигенов с антите­лами лежит в основе определения групп крови, когда происходит «склеивание» эритроцитов антителами той или иной специфич­ности. Эта реакция получила название гемагглютинации и очень широко используется на практике. Этот метод также широко при­меняется при определении белков плазмы крови в концентрации до 1 мг/л. Однако методы агглютинации вследствие довольно низ­кой точности относятся только к качественным или полуколиче­ственным методам анализа.

Для расширения пределов чувствительности и повышения спе­цифичности иммунохимических тестов в один из компонентов системы вводят маркер, концентрацию которого можно легко определять. После отделения продуктов реакции от исходных ком­понентов находят концентрацию АГАТ и по калибровочному гра­фику рассчитывают содержание АГ.

Концентрацию антигена определяют из принципа конкурент­ного связывания антителами меченого и немеченого антигенов. Происходит следующая реакция:

АГ + АГ* + AT = АТАГ + АТАГ*

 

где АГ и АГ* — определяемый антиген без метки и с меткой; AT -антитела; АТАГ и АТАГ* — соответствующие комплексы.

Итак, если в пробирку с раствором, содержащим постоянную концентрацию антител и меченого антигена, добавить разные количества немеченого антигена, то концентрация комплекса АТАГ* (с меткой) будет обратно пропорциональна концентра­ции немеченого антигена. Для того чтобы отделить комплексы АТАГ от несвязавшихся компонентов анализируемой смеси, AT или АГ ковалентно связывают с твердой фазой, например с полистероловыми шариками. После промывки твердой фазы отделяют свя­завшиеся и несвязавшиеся компоненты. Такой тип анализа назы­вают гетерогенным (принцип двух фаз: твердой и жидкой).

С большим успехом в гинекологическую практику вошел экс­пресс-метод определения беременности по уровню хориогонического гонадотропина в моче. Тесты таких типов можно проводить не только в специальных лабораториях, но и в домашних услови­ях. В качестве практического примера использования твердофаз­ного иммуноферментного анализа ELISA можно рассмотреть ме­тод определения хорионического гонадотропина. В этом методе на полистирольные шарики сорбируются моноклональные антитела к хорионическому гонадотропину. К сенсибилизированным ша­рикам добавляют исследуемую пробу (мочу) и конъюгат, состо­ящий из маркера и моноклональных антител, меченных пероксидазой. В результате иммунологической реакции хорионический гонадотропин связывается одной детерминантой с моноклональными антителами, иммобилизованными на поверхности шариков, а дру­гой — с моноклональными антителами коньюгата с маркером. Затем шарики отмывают от всех несвязавшихся компонентов мочи и определяют активность фермента в составе иммунных комплек­сов с помощью субстрат-хромогенной смеси. При этом степень окраски раствора будет прямо пропорциональна количеству хо­рионического гонадотропина в образце мочи.

Лекарственный мониторинг также осуществляется посредством использования методов иммунохимического анализа. Необходимость контроля за концентрацией лекарственного препарата в процессе терапии у больного возникает при следующих ситуациях:

· длительных курсовых приемах лекарственных средств;

· низком терапевтическом эффекте или полном его отсутствии;

· возникновении побочных явлений в случае превышения те­рапевтической дозы препарата;

· трудно определяемом фармакологическом эффекте;

· особых обстоятельствах (например, при лечении новорожден­ных).

Лекарственный мониторинг может применяться, например, при терапии такими препаратами, как бронхолитик теофиллин, сер­дечный гликозид дигоксин и т.д. Известно, что успешный клини­ческий результат зависит не от дозы препарата, а от его концен­трации в плазме крови. Поэтому при достижении одного и того же лечебного эффекта у разных больных лекарственная дозировка пре­парата может разниться в десятки раз. Совершенно очевидно, что в этих случаях необходим индивидуальный подбор доз для каждо­го пациента. Кроме того, мониторинг лекарственных средств ис­ключает передозировку лекарственного препарата и, соответствен­но, проявления токсических эффектов.

Рентабельными, экспрессными методами определения низко­молекулярных соединений в плазме крови являются иммуноаналитические методы, которые отличаются универсальностью (при­менимы к любому веществу, способному к индукции антител), высокой селективностью и чувствительностью; не требуют пред­варительной обработки образцов и имеют сравнительно низкую стоимость.

Известно, что иммунизация низкомолекулярными вещества­ми не может вызывать иммунный ответ, поэтому для получения антител нужно предварительно лекарственный препарат ковалентно связать с иммуногенным высокомолекулярным носителем. Сна­чала лекарственное вещество делают реакционноспособным, вводя разные функциональные группы, которые затем взаимодейству­ют с соответствующими функциональными группами белка и об­разуют так называемый синтетический конъюгированный анти­ген. При иммунизации животного таким комплексным антигеном будут образовываться поликлональные антитела, т.е. антитела к антигенным детерминантам самого белка и к антигенным детер­минантам лекарственного средства.

В настоящее время иммунодиагностические тест-системы с использованием поликлональных антител созданы практически для всех лекарственных препаратов. При проведении лекарствен­ного мониторинга с использованием методов иммунохимического анализа в качестве «маркеров» применяются:

· радиоактивные метки (радиоиммунный анализ с использова­нием радиоактивных атомов-трития, радиоактивного йода и др.);

· ферментные метки (если ферменты стабильны, активны и
действуют в минимальных концентрациях);

· субстратные метки (АТФ и НАД), которые «пришиваются» к молекуле антигена через адениновый остаток и сохраняют спо­собность взаимодействия с ферментом.

В качестве примера можно привести радиоиммунный метод количественного определения инсулина, основные принципы которого рассмотрим более подробно.

Общеизвестно, что инсулин влияет на концентрацию глюкозы в крови. В лабораторных условиях при наличии животных можно по снижению уровня глюкозы в крови сравнивать отдельные пре­параты инсулина. Но этот путь совершенно неприемлем для опре­деления инсулина в крови больных, учитывая, что в контроле фактически нуждается если не миллионный, то многотысячный контингент больных. Клиническая лаборатория обязана опреде­лять количество эндогенного инсулина в крови больных, кото­рым предписано введение инсулина извне. В противном случае возможны передозировки инсулина. Метод отличается высокой из­бирательностью (на результаты не влияют любые белки крови) и высокой точностью. В качестве лабораторного оборудования необ­ходимы стандартный гамма-счетчик (например ГСБ-1) и ком­мерческий набор реагентов (в него входят меченый (по йоду) инсулин, у которого кодированы остатки тирозина и гистидина; антисыворотка к инсулину (антитела к инсулину), получаемая из крови кроликов, которым вводили инсулин).

У больного отбирается проба крови, где количество эндоген­ного (немеченого) инсулина неизвестно (х). Создается реакцион­ная смесь: меченый инсулин + антисыворотка (фиксированное количество), т.е. комплекс антигена с антителом, который затем осаждается. Количество метки в осадке, определяемое радиомет­рическим методом, соответствует количеству меченого инсулина. Принцип анализа: если в реакционную смесь одновременно с меченым инсулином вводится проба крови с эндогенным инсу­лином, то количество метки в осадке будет тем меньше, чем больше х. В данной ситуации возникает конкуренция за антитело между меченым и немеченым инсулином. Количество немеченого инсулина не должно резко превышать количество меченого, ина­че возможны погрешности в точности измерения. В соответствии с этим пробы крови принято разводить: х, x/1, х/4 и т.д. Избы­ток меченого инсулина помешать не может, так как метка опре­деляется в осадке — там, где находится только связанный с анти­телом меченый инсулин. Расчеты проводятся по калибровочным кривым. Метод пригоден для определения числа микрограммов инсулина в 1 мл крови и не требует предварительных препаратив­ных процедур. Один счетчик типа ГСБ-1 дает возможность анали­за нескольких сотен проб в неделю. Радиоиммунный анализ удо­бен для мониторинга не только инсулина, но и многих других биологически активных агентов.

Существуют гетерогенные и гомогенные иммуноферментные методы: с разделением компонентов после проведения иммунохимической реакции (роль пассивного маркера выполняет фер­мент, не меняющий своей активности в ходе реакции) и без раз­деления компонентов (также используется ферментная метка, активность которой в ходе иммунной реакции меняется).

Гетерогенный иммуноферментный анализ основан на конку­рентной реакции антител с исследуемым веществом и меченым веществом с последующим отделением антител и измерением активности фермента, связавшегося с ними.

Гомогенный иммуноферментный метод основан на способно­сти антител модулировать активность некоторых ферментов, ковалентно связанных с измеряемым веществом. Антитела влияют на конформацию активного центра фермента, а добавление сво­бодного вещества восстанавливает активность фермента. Чувстви­тельность гомогенных методов, как правило, меньше, чем гете­рогенных, но вполне достаточна для определения практически всех лекарственных препаратов и даже некоторых гормонов. Гомо­генные методы достаточно просты; анализ проводится в одну ста­дию и длится несколько минут.

Также в иммуноанализе используют липосомы, содержащие метку. Существует множество модификаций этого метода, напри­мер, на мембране липосом находится антиген, взаимодейству­ющий с антителами в присутствии комплемента и вызывающий лизис липосом с последующим высвобождением метки.

Существуют также и неинструментальные полуколичественные методы экспресс-анализа на бумаге, например на многослойных целлюлозных полосках, которые пропитывают разными реаген­тами иммунохимической реакции и затем склеивают вместе на пластике. Такой же принцип последовательного взаимодействия находится в основе еще одного полуколичественного метода — иммунохроматографического. На полоску бумаги сорбируют ан­титела. Затем конец этой полоски вносится в раствор пробы и конъюгата. В процессе диффузии раствора вверх по полоске мече­ный и свободный лекарственный препарат конкурентно взаимо­действует с антителами, вызывая их насыщение. Чем больше кон­центрация препарата в пробе, тем выше будет зона насыщения. Затем следует проявление (детекция) полоски в растворе субстрата. Высота окрашенного столбика определяет концентрацию препа­рата в исследуемом образце (пробе).

 

Контрольные вопросы

 

1. Важные области использования иммунохимического анализа.

2. Области применения моноклональных антител.

3. Способы супрессии иммунного ответа с помощью иммунобиопрепаратов.

4. Метод гибридомной технологии.

 

Лекция 30

Создание вакцин

Форма проведения лекции: проблемная

План лекции

 

1. Создание вакцин.

2. Классификация вакцин

2.1 Живые вакцины.

2.2 Неживые (инактивированные) вакцины.

2.3 Комбинированные вакцины.

3. Сыворотки.

 

1. Вирусы – облигатные (безусловные) внутриклеточные паразиты, чья репликация полностью зависит от процессов синтеза ДНК, РНК белков в клетке хозяина. Репликация вирусов включает несколько этапов:

- адсорбция и проникновение в клетку;

- синтез ранних, неструктурных белков, например, полимераз, нуклеиновых кислот;

- синтез РНК или ДНК;

- синтез конечных структурных белков;

- сборка (созревание) вирусных частиц и их выход из клетки.

При многих вирусных инфекциях репликация вируса достигает максимума во время появления первых клинических признаков заболевания или даже ранее. Формирование у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам способствует вакцинация. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение вакцины в организм, запускают иммунный ответ – вырабатываются антитела, которые при последующей инфекции блокируют пролиферацию патогенного микроорганизма и не позволяют развиться заболеванию.

Эффект вакцинации был открыт более 200 лет назад (1796 г.) врачом Эдвардом Дженнером, доказавшим, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчив к оспе натуральной. Натуральная оспа – высококонтагиозное (заразное) заболевание, с высокой смертностью, даже, если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства, слепота. Э.Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем, через определенное время, дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограничились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней.